NOXIN在肝癌中作用和機制研究及LZP對肝臟脂質(zhì)代謝影響研究.pdf

1、第一部分、NOXIN在肝癌中作用和機制研究
　　目的：基因組DNA拷貝數(shù)的變化是人類惡性疾病，特別是惡性腫瘤的標志之一。但是，到底何種原癌基因或抑癌基因DNA拷貝數(shù)的變化引起了肝細胞肝癌的發(fā)生發(fā)展尚不確定。本研究中，我們試圖通過對人肝癌樣本DNA拷貝數(shù)分析來發(fā)現(xiàn)伴隨DNA拷貝數(shù)變異的新的潛在的原癌基因或抑癌基因。
　　方法：我們采用單核苷酸多態(tài)性全基因組水平DNA拷貝數(shù)分析來研究人肝癌樣本的DNA拷貝數(shù)的變化。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合

2、酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和免疫組織化學(xué)染色(immunohistochemical staining,IHC)的方法評價了肝癌組織樣本中NOIXN基因的表達水平。對肝癌細胞株過表達或干擾NOXIN基因的表達后，我們分別通過生長曲線、平板克隆形成、軟瓊脂克隆形成評價NOXIN基因?qū)Ω伟┘毎晟L能力的影響，通過劃痕實驗、trans-well實驗

3、評價了NOXIN基因?qū)Ω伟┘毎赀w移能力的影響，通過流式細胞術(shù)分析評價了NOXIN基因?qū)Ω伟┘毎昙毎芷诘挠绊懀ㄟ^裸鼠成瘤實驗評價了NOXIN基因?qū)Ω伟┘毎牦w內(nèi)成瘤能力的影響，通過免疫共沉淀(Reciprocal co-immunoprecipitation,Co-IP)實驗評價了NOXIN蛋白與DNA聚合酶α之間的相互作用，通過免疫熒光(immunofluorescence,IF)評價了NOXIN蛋白肝癌細胞株中的定位情況。結(jié)果

4、：通過對人43對肝癌組織樣本全基因組水平DNA拷貝數(shù)分析，我們發(fā)現(xiàn)了一個最小擴增區(qū)，其中包括我們的研究對象NOXIN基因。NOXIN基因表達上調(diào)與肝細胞肝癌的腫瘤分級顯著相關(guān)。過表達NOXIN基因促進了腫瘤細胞的增殖、克隆形成、轉(zhuǎn)移和體內(nèi)腫瘤形成，而RNA干擾NOXIN基因的表達分別抑制了腫瘤細胞的增殖、克隆形成、轉(zhuǎn)移和體內(nèi)腫瘤形成。有趣的是，通過Brdu摻入實驗，我們發(fā)現(xiàn)NOXIN基因過表達通過增強肝細胞肝癌細胞株DNA從頭合成從而促

5、進了細胞周期G1向S期的轉(zhuǎn)化。我們進一步發(fā)現(xiàn)，NOXIN蛋白與DNA聚合酶α之間相互作用，提示NOXIN基因可能是通過促進了DNA聚合酶引物酶復(fù)合體的形成從而促進了DNA的從頭合成。
　　結(jié)論：基因組水平DNA擴增增加促進了NOXIN基因的過表達，從而通過促進DNA合成與細胞周期進程加快促進了肝細胞肝癌的發(fā)生發(fā)展。在此過程中，NOXIN蛋白通過與DNA聚合酶α的相互作用發(fā)揮作為DNA聚合酶引物酶復(fù)合體共分子的功能。
　　第二

6、部分LZP對肝臟脂質(zhì)代謝影響研究
　　目的：脂肪肝與肝癌嚴重影響我國人民健康，二者常常伴隨發(fā)生。部分脂肪肝患者可以發(fā)展成脂肪性肝炎，進而導(dǎo)致肝癌發(fā)生，但其分子機制不清除。有意義的是本課題組發(fā)現(xiàn)和鑒定的LZP(Liver specific ZP domain containing protein)基因在肝癌表達普遍且顯著下降，而LZP基因剔出小鼠顯示肝臟脂肪沉積，脂質(zhì)代謝紊亂，提示LZP缺乏導(dǎo)致脂肪肝，進而可能影響肝癌發(fā)生、發(fā)展。本

7、研究擬基于LZP基因剔出小鼠模型結(jié)合人肝癌樣本和細胞研究LZP在肝臟脂質(zhì)代謝過程中的作用、其缺乏對肝癌發(fā)生、發(fā)展的影響及其分子機制;在此基礎(chǔ)上，探討LZP或者相關(guān)致癌分子機制作為靶向防治肝癌策略的可行性。
　　方法：通過對小鼠血液生化指標的檢測評價LZP對脂質(zhì)代謝相關(guān)指標的影響，通過組織學(xué)檢查評價LZP對肝臟形態(tài)學(xué)的影響，通過免疫組化和免疫熒光評價LZP在肝臟細胞中的定位，通過免疫印跡評價LZP是否分泌及對脂質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白的影響，

8、通過免疫共沉淀評價LZP與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白的相互作用。
　　結(jié)果：血液生化指標的檢測發(fā)現(xiàn)外周血甘油三酯（TG）含量下降。組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)肝細胞空泡化增加，油紅染色深染增加，血清和肝臟勻漿液中脂質(zhì)定量分析發(fā)現(xiàn)，肝臟中甘油三酯增加，血清中甘油三酯下降。免疫組化和免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)，LZP蛋白主要定位于細胞交界處，免疫印跡發(fā)現(xiàn)LZP可分泌與細胞培養(yǎng)上清中。同時我們發(fā)現(xiàn)，LZP蛋白表達增加可以增加脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白ApoB含量，免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)LZP與脂