AMPK在炎癥誘導的肝臟脂質(zhì)沉積中的作用.pdf

1、第一部分炎癥誘導的肝臟脂質(zhì)沉積的建立
　　目的：臨床研究發(fā)現(xiàn)，炎癥可能參與了非酒精性脂肪肝（NAFLD）早期的脂肪沉積過程，但機制尚未闡明。因此，在本部分的研究中，我們旨在構建炎癥誘導的肝臟脂質(zhì)沉積的動物與細胞模型，為進一步的機制研究做準備。
　　方法：①動物模型：酪蛋白是近年來常用的小鼠慢性炎癥刺激因子，因此，我們將6-8周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機分為炎癥組（Casein， n=7）和對照組（NC，n=7）。炎癥組隔

2、日皮下注射0.5 ml10％酪蛋白，對照組注射相應劑量的生理鹽水，總時間為18周。收集小鼠血清，檢測炎癥因子 MCP-1、TNF-α、IL-6的水平。取小鼠肝臟組織經(jīng)油紅 O染色、TG定量檢測肝臟組織脂質(zhì)沉積情況， qRT-PCR檢測肝臟脂代謝關鍵基因的表達。②細胞模型1：在體內(nèi)，Kupffer細胞是肝臟炎癥的主要來源細胞，我們利用 LPS刺激 Kupffer細胞，檢測其炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1的含量，并用該

3、上清液干預HepG2肝細胞，模擬體內(nèi)Kupffer細胞與肝細胞共生長環(huán)境，后油紅O染色、TG定量檢測HepG2肝細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的變化， qRT-PCR檢測肝細胞脂代謝關鍵基因的表達；③細胞模型2：TNF-α是重要的炎癥因子之一，為了建立更為單純的炎癥干預的細胞模型，我們用外源性 TNF-α20ng/mL干預HepG2細胞24h后，油紅O染色、TG定量檢測HepG2細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況，qRT-PCR以及Western blot方法檢脂質(zhì)合

4、成關鍵基因的mRNA和蛋白水平的變化。
　　結果：①動物模型：與對照組相比，酪蛋白注射顯著增加C57BL/6J小鼠血中炎癥因子 MCP-1、TNF-α、IL-6的水平，肝臟脂質(zhì)沉積明顯，脂代謝紊亂。②細胞模型1：LPS刺激明顯增加Kupffer細胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1的含量，上清液干預HepG2細胞后，細胞脂質(zhì)含量顯著增加，脂代謝異常。③細胞模型2：與對照組相比，TNF-α促進 HepG2肝

5、細胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積，脂質(zhì)合成關鍵基因SREBP1、FAS的表達明顯升高。
　　結論：成功構建炎癥誘導的肝脂質(zhì)沉積的動物與細胞模型。
　　第二部分：AMPK在炎癥誘導的肝臟脂質(zhì)沉積中的作用以及可能的機制
　　目的：腺苷酸活化蛋白激酶(Amp-activated protein kinase, AMPK)是生物體內(nèi)重要的能量感受器，參與脂代謝過程。在第一部分的研究中，我們已經(jīng)觀察到炎癥誘導肝臟脂質(zhì)沉積。然而，在此過程中，AM

6、PK通路是否發(fā)揮作用尚不清楚。因此，本部分的研究旨在炎癥誘導的脂質(zhì)沉積模型中，探討AMPK通路的作用以及可能的機制，為非酒精性脂肪肝的防治提供新的思路。
　　方法：①Western blotting檢測第一部分研究建立的炎癥誘導的肝臟脂質(zhì)沉積的動物與細胞模型中 AMPK以及下游 ACC的磷酸化水平以反映AMPK通路激活情況；②探討AMPK通路是否介導了炎癥誘導的肝臟脂質(zhì)沉積：在TNF-α誘導的HepG2肝細胞模型中，加用AMPK激

7、動劑二甲雙胍1mM或AICAR1mM，或二甲雙胍1mM聯(lián)合AMPK抑制劑Compound C40μM，干預24h后，通過油紅O染色、TG定量檢測觀察細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚情況；Western blotting和qRT-PCR檢測細胞AMPK/mTOR/SREBP1通路的表達變化。
　　結果：①與對照組相比，炎癥小鼠肝臟組織 AMPK以及下游 ACC的磷酸化水平降低； Kupffer細胞上清液干預肝細胞后，肝細胞 AMPK以及ACC磷酸化明

8、顯減少；在TNF-α作用下，HepG2細胞AMPK以及ACC磷酸化顯著降低。②在TNF-α誘導的肝細胞脂質(zhì)沉積模型中，加用二甲雙胍或AICAR后，細胞內(nèi)TG含量顯著降低，脂質(zhì)沉積得到改善，進一步檢測發(fā)現(xiàn)，AMPK以及ACC磷酸化水平明顯增加，AMPK激活增多， mTORSer2448以及 p70S6K Thr421/Ser424位點的磷酸化水平顯著降低，脂質(zhì)合成關鍵基因SREBP1、FAS的表達顯著減少；而加入二甲雙胍聯(lián)合Compoun