利魯唑在脂多糖誘導(dǎo)眼內(nèi)炎癥中的干預(yù)研究.pdf

1、眼外傷、內(nèi)眼手術(shù)是感染性眼內(nèi)炎的主要原因，多為細(xì)菌進(jìn)入眼內(nèi)導(dǎo)致感染所致，如凝固酶陰性葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、革蘭氏陰性細(xì)菌等。細(xì)菌性眼內(nèi)炎是嚴(yán)重威脅視力的眼科急癥，細(xì)菌性眼內(nèi)炎預(yù)后受細(xì)菌數(shù)量、毒力、患者年齡及免疫狀態(tài)等多種因素影響。雖然及時(shí)采取抗生素藥物治療、玻璃體切除術(shù)等治療，但是視力預(yù)后仍不理想，常導(dǎo)致嚴(yán)重的視功能損害。細(xì)菌在增殖、破裂的過程中釋放的毒性物質(zhì)（內(nèi)毒素、外毒素）可誘發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞壞死[1,2,3]。其

2、中細(xì)菌的裂解產(chǎn)物是誘發(fā)眼內(nèi)炎癥的重要因素之一。脂多糖是革蘭陰性桿菌細(xì)胞壁的主要成分，也是其主要毒性致病因子，可用于玻璃體腔注射，誘導(dǎo)感染性眼內(nèi)炎癥反應(yīng)[4]。炎癥反應(yīng)導(dǎo)致血眼屏障破壞，炎性細(xì)胞向組織間隙遷移浸潤，蛋白滲漏，精密的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)被破壞，最終導(dǎo)致功能不同程度的喪失。如何消除眼內(nèi)炎中眼內(nèi)組織破壞、改善最終視力預(yù)后一直是我們面臨的難題和挑戰(zhàn)。在積極抗菌治療的同時(shí)，能否有效并及時(shí)地控制眼內(nèi)炎癥反應(yīng)是治療的關(guān)鍵，也是預(yù)后的決定性因素。<

3、br>　　利魯唑（Riluzole）屬于苯并噻唑類衍生物，1996年開始作為一種新型谷氨酸釋放抑制劑被批準(zhǔn)應(yīng)用于肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)的治療，其穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)外離子濃度的作用使其在神經(jīng)保護(hù)、抗驚厥、抗抑郁等方面具有廣泛的作用，提示其在更多疾病中的臨床應(yīng)用價(jià)值。根據(jù)其藥理機(jī)制，我們推測其可能在眼內(nèi)炎癥控制中起到積極作用。本研究擬觀察利魯唑?qū)χ嗵钦T導(dǎo)大鼠眼內(nèi)炎癥的干預(yù)作用，

4、并對其機(jī)制進(jìn)行初步研究。
　　目的：
　　通過玻璃體腔注射大腸桿菌脂多糖(LPS,lipopolysaccharide from Escherichia coli)建立大鼠眼內(nèi)炎模型，觀察其炎癥表現(xiàn)、組織病理學(xué)特征以及利魯唑的干預(yù)作用，然后對其作用機(jī)制進(jìn)行研究，為眼內(nèi)炎的治療提供新線索。
　　材料與方法：
　　將Sprague-Dawley（SD）大鼠隨機(jī)分為3組，1組：生理鹽水對照組；2組：眼內(nèi)炎組；3組：眼內(nèi)

5、炎利魯唑干預(yù)組。生理鹽水組大鼠右眼注入5μl無菌生理鹽水。2、3組大鼠右眼玻璃體腔內(nèi)注入LPS(2μg,5μl)，建立LPS誘導(dǎo)的眼內(nèi)炎模型。左眼為正常對照眼。利魯唑干預(yù)組在LPS注射前12 h和術(shù)中及術(shù)后連續(xù)3 d腹腔內(nèi)注射利魯唑注射液(0.1％,10mg/kg)。
　　第一部分：造模后6h、12h、24h、48h、3d、5d、7d進(jìn)行眼部炎癥評分，病理組織學(xué)檢查觀察炎癥細(xì)胞浸潤，行免疫組化測定谷氨酰胺合成酶（glutamine

6、 synthetase，GS）在視網(wǎng)膜組織的表達(dá)變化及分布，采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測視網(wǎng)膜組織中GS的表達(dá)情況，觀察利魯唑的干預(yù)作用。第二部分：對利魯唑的干預(yù)機(jī)制進(jìn)行初步探討，分光光度計(jì)法測定玻璃體中谷氨酸（glutamate，Glu）含量，采用TUNEL法檢測視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡。
　　所有數(shù)據(jù)均用（x±s）表示，應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)

7、行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.臨床炎癥評分
　　玻璃體腔內(nèi)注射LPS誘導(dǎo)出典型眼內(nèi)炎臨床表現(xiàn)，造模后干預(yù)組炎癥反應(yīng)明顯較2組輕，造模后24 h、48h、3d時(shí)間點(diǎn)兩組臨床炎癥評分間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。1組未見明顯炎癥反應(yīng)。
　　2.病理組織學(xué)檢查
　　常規(guī)HE染色后顯微鏡下觀察白細(xì)胞浸潤，對切片中以鋸齒緣為前界的玻璃體腔中的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核-巨噬

8、細(xì)胞等炎癥細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。2組、3組在造模后均可觀察到大量外周血白細(xì)胞眼內(nèi)的浸潤。HE染色顯示各時(shí)間點(diǎn)3組玻璃體內(nèi)炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)低于2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而Ⅰ組造模后玻璃體腔、視網(wǎng)膜大部分未見、或散在少量的炎癥細(xì)胞浸潤，視網(wǎng)膜形態(tài)基本正常，結(jié)構(gòu)清晰。
　　與1組相比，GS在眼內(nèi)炎組的表達(dá)升高，主要表達(dá)于內(nèi)顆粒層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層Müller細(xì)胞胞漿中。2組、3組在6h、12h、24h、48h、3dGS的表達(dá)具有顯著性

9、差異(P＜0.05)，3組GS的表達(dá)明顯低于2組，但仍高于對照組。
　　3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測視網(wǎng)膜組織GS的表達(dá)
　　48h時(shí)，對照組視網(wǎng)膜中檢測到低水平表達(dá)，眼內(nèi)炎組GSmRNA表達(dá)較對照組明顯增強(qiáng)（P<0.05），利魯唑干預(yù)組GSmRNA表達(dá)較眼內(nèi)炎組降低（P<0.05），但仍高于對照組。
　　4.谷氨酸濃度
　　2組和3組大鼠玻璃體中谷氨酸含量在炎癥初期就開始升高，48h時(shí)達(dá)到高峰，分別為324.

10、01±2.47μmol/l、253.95±10.76μmol/l。2組在5d時(shí)谷氨酸濃度較之前出現(xiàn)小幅回升（298.04±4.83μmol/l），然后逐漸下降。6h后各時(shí)間點(diǎn)，3組造模眼玻璃體谷氨酸濃度明顯低于2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但仍明顯高于1組。
　　5. LPS誘導(dǎo)眼內(nèi)炎后，TUNEL染色陽性細(xì)胞散在分布于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)顆粒層，3d時(shí)出現(xiàn)凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多。2組細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯多于3組。生理鹽水

11、對照組視網(wǎng)膜未見明顯細(xì)胞凋亡，6h，12h，24h時(shí)眼內(nèi)炎組與干預(yù)組相比細(xì)胞凋亡程度無明顯差異，其后各時(shí)間點(diǎn)3組凋亡細(xì)胞指數(shù)均低于同期眼內(nèi)炎組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　利魯唑可以抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的眼內(nèi)炎中炎癥細(xì)胞的眼內(nèi)浸潤，減少組織損害，其機(jī)制可能是通過減少視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡，使玻璃體谷氨酸含量降低，抑制 Müller細(xì)胞活化。該研究結(jié)果提示利魯唑在細(xì)菌性眼內(nèi)炎中的保護(hù)作用，為眼內(nèi)炎的輔助治療提供依