TOLL樣受體4在脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性腎功能衰竭中的作用研究.pdf

1、第一部分、TOLL樣受體4在脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性腎功能衰竭中的表達(dá)及意義
　　 論文1：TLR4與小鼠內(nèi)毒素型急性腎功能衰竭的相關(guān)性研究
　　 目的：研究TOLL樣受體4(TOLL like receptor 4，TLR4)與內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠急性腎功能衰竭(ARF)的相關(guān)性關(guān)系。
　　 方法：建立脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)15mg/kg單次腹腔注射誘導(dǎo)雄性C57BL/6小鼠內(nèi)毒素性急性

2、腎功能衰竭模型。分別于注射后第12h、24h、36h、48h的時(shí)間點(diǎn)采集血液及組織標(biāo)本。檢測(cè)血肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)及用Nomura評(píng)分法對(duì)腎組織病理改變進(jìn)行半定量評(píng)分。應(yīng)用免疫組織化學(xué)SABC法對(duì)正常對(duì)照組(NG)及急性腎功能衰竭(ARF)組小鼠腎組織標(biāo)本中的TLR4進(jìn)行定位及半定量分析；Western blot檢測(cè)兩組腎組織總TLR4蛋白的改變；RT-PCR檢測(cè)各組小鼠腎組織總TLR4 mRNA的表達(dá)變化。TUNEL法檢測(cè)兩

3、組腎組織中凋亡小體情況。
　　 結(jié)果：注射LPS后模型組BUN、Cr逐漸上升，24h達(dá)高峰(BUN 28.14±2.55mmol/L，Cr 207.73±12.1μmol/L),約48h后逐漸恢復(fù)正常；與NG組相比，ARF組的TLR4蛋白及mRNA水平的表達(dá)顯著上調(diào)，以造模24h時(shí)最明顯；TUNEL法結(jié)果顯示凋亡小體主要出現(xiàn)在ARF組腎臟的近端小管及管周圍，腎小球無明顯變化。TLR4蛋白的光密度值與Cr、BUN值的相關(guān)系數(shù)分別為

4、0.907、0.926；與腎組織凋亡的光密度值的相關(guān)系數(shù)為0.954；腎組織凋亡的光密度值與Cr、BUN值的相關(guān)系數(shù)分別為0.932、0.951。
　　 結(jié)論：TLR4、腎組織凋亡均與小鼠內(nèi)毒素型ARF的腎功能改變呈正相關(guān)關(guān)系，同時(shí)TLR4與腎組織凋亡也呈正相關(guān)關(guān)系，TLR4可能通過促進(jìn)腎組織細(xì)胞凋亡參與ARF的發(fā)生。
　　 論文2：應(yīng)用基因缺失小鼠研究TOLL樣受體4在脂多糖誘導(dǎo)的急性腎功能衰竭中的作用
　　

5、目的：進(jìn)一步明確TOLL樣受體4(TLR4)在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠急性腎功能衰竭(ARF)腎臟中的作用機(jī)制。
　　 方法：以TLR4基因缺失的C3H/HeJ小鼠和其野生正常對(duì)照的C3H/HeN小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。實(shí)驗(yàn)分TLR4+(C3H/HeN)組、TLR4-(C3H/HeJ)組小鼠，單次性腹腔注射LPS(15mg/kg)誘導(dǎo)小鼠ARF模型。24h后檢測(cè)血清肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)值來評(píng)估腎功能；Nomura評(píng)分法對(duì)腎組

6、織病理改變進(jìn)行半定量評(píng)分；免疫組織化學(xué)SABC法檢測(cè)TLR4在兩組小鼠腎組織中的表達(dá)、RT-PCR法檢測(cè)腎組織總TLR4 mRNA的表達(dá)變化、免疫蛋白印跡檢測(cè)腎組織總TLR4蛋白水平；TUNEL法檢測(cè)腎臟組織的凋亡情況。
　　 結(jié)果：TLR4+(C3H/HeN)組的Cr、BUN分別為202.26±11.08umol/L、20.36±1.52mmol/L，TLR4-(C3H/HeJ)組的Cr、BUN分別為109.67±13.32u

7、mol/L、6.42±0.41mmol/L，差異有顯著性(P＜0.01)；TLR4-(C3H/HeJ)組的腎組織結(jié)構(gòu)正常，無明顯的病理改變，而TLR4+(C3H/HeN)組小鼠腎小管呈輕中度的病理改變，主要表現(xiàn)為近端腎小管管腔擴(kuò)大、空泡形成等；與TLR4-(C3H/HeJ)組相比，TLR4+(C3H/HeN)組的TLR4蛋白及mRNA表達(dá)明顯上調(diào)；TUNEL法顯示凋亡小體主要出現(xiàn)在TLR4+(C3H/HeN)組小鼠腎臟的近端小管及管周圍

8、，腎小球無明顯凋亡小體出現(xiàn)，TLR4-(C3H/HeJ)組小鼠腎組織中未檢測(cè)到凋亡小體，二者平均光密度值差異有顯著性(0.117±0.008 vs 0.038±0.003,P＜0.001)。
　　 結(jié)論：TLR4在LPS誘導(dǎo)的小鼠急性腎功能衰竭的發(fā)病中重要作用。LPS可能通過激活TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起腎組織中腎小管上皮細(xì)胞凋亡過度，腎小管上皮細(xì)胞數(shù)量減少，從而導(dǎo)致急性腎功能衰竭的發(fā)生。
　　 第二部分、脂多糖刺激下人腎

9、小管上皮細(xì)胞TLR4的表達(dá)研究
　　 論文1：LPS促進(jìn)人近端腎小管上皮細(xì)胞TLR4的表達(dá)
　　 目的：研究人近端腎小管上皮細(xì)胞(HKC)在脂多糖(LPS)刺激下Toll樣受體4(TLR4)的表達(dá)及作用。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分兩組，LPS刺激組(50ng/ml LPS加入體外培養(yǎng)的HKC)和正常對(duì)照組；應(yīng)用免疫熒光染色在激光共聚焦顯微鏡下觀察LPS刺激24小時(shí)后TLR4在HKC中的分布及表達(dá)強(qiáng)弱；半定量RT-P

10、CR和免疫蛋白印跡檢測(cè)各組 TLR4及內(nèi)參照β-actin在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)量；Annexin V-FITC結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的早期凋亡率情況。
　　 結(jié)果：LPS刺激組TLR4的免疫熒光強(qiáng)度顯著高于正常對(duì)照組，TLR4主要分布于HKC的胞膜及胞漿區(qū)；刺激組TLR4 mRNA表達(dá)高于正常對(duì)照組(1.051±0.082 vs 0.38±0.036)，差異有顯著性(P＜0.01)；刺激組TLR4蛋白表達(dá)高于正常對(duì)

11、照組(0.371±0.033 vs 0.105±0.008)，差異有顯著性(P＜0.01)；LPS刺激組細(xì)胞的早期凋亡率(41.29[％])顯著高于正常對(duì)照組(2.36[％])。
　　 結(jié)論：LPS能刺激HKC高表達(dá)TLR4，且促進(jìn)HKC的早期凋亡，TLR4可能在LPS誘導(dǎo)的HKC凋亡中發(fā)揮一定的作用。
　　 第三部分、特異性shRNA對(duì)HEK 293細(xì)胞和人腎小管上皮細(xì)胞TLR4表達(dá)抑制的作用研究
　　 論文

12、1：特異性shRNA抑制HEK 293細(xì)胞TOLL樣受體4的表達(dá)
　　 目的：研究RNA干擾法對(duì)人胚腎細(xì)胞(HEK 293)中Toll樣受體4(TLR4)表達(dá)的抑制作用。
　　 方法：采用體外轉(zhuǎn)錄的方法生物合成針對(duì)TLR4分子設(shè)計(jì)的特異性短發(fā)卡RNA(shRNA)雙鏈分子，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法導(dǎo)入體外培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分三組：干擾組(將針對(duì)TLR4的特異性shRNA轉(zhuǎn)染正常HEK293細(xì)胞)，陰性對(duì)照組(將非

13、特異性的陰性對(duì)照的shRNA轉(zhuǎn)染正常HEK293細(xì)胞)及正常組(無轉(zhuǎn)染)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)shRNA分子的轉(zhuǎn)染效率；應(yīng)用免疫熒光染色在共聚焦顯微鏡下觀察TLR4的分布及表達(dá)強(qiáng)弱；半定量RT-PCR和免疫蛋白印跡檢測(cè)TLR4及內(nèi)參照β-actin在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)量。
　　 結(jié)果：特異性的針對(duì)TLR4的shRNA雙鏈分子在HEK293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率達(dá)82.47[％]；干擾組TLR4的免疫熒光強(qiáng)度顯著低于陰性對(duì)照組及正常組細(xì)

14、胞，TLR4主要分布于HEK293 細(xì)胞的胞膜及胞漿區(qū)。干擾組細(xì)胞的TLR4 mRNA的光密度比值顯著低于陰性對(duì)照組及正常組(0.35±0.003 vs 0.98±0.061 vs 0.955±0.058)；干擾組細(xì)胞的TLR4蛋白的光密度比值顯著低于陰性對(duì)照組及正常組(0.089±0.007 vs 0.153±0.011 vs 0.142±0.001)。
　　 結(jié)論：采用生物體外轉(zhuǎn)錄的方法成功合成針對(duì)TLR4的shRNA雙鏈分

15、子，并有效地轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞中使TLR4的表達(dá)下調(diào)。
　　 論文2:特異性shRNA抑制LPS刺激下TLR4對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞的促凋亡作用
　　 目的：研究體外轉(zhuǎn)錄生物合成的shRNA對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞(HKC)中Toll樣受體4(TLR4)表達(dá)及TLR4對(duì)HKC細(xì)胞促凋亡的抑制作用。
　　 方法：用體外轉(zhuǎn)錄的方法生物合成針對(duì)TLR4分子的特異性短發(fā)卡RNA(shRNA)雙鏈分子，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法導(dǎo)入在脂多

16、糖(LPS)刺激下的體外培養(yǎng)的HKC；實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分四組：LPS組(在培養(yǎng)的HKC中加入50ng/ml的LPS)、LPS+干擾組(在培養(yǎng)的HKC中加入50ng/ml的LPS的同時(shí)轉(zhuǎn)染針對(duì)TLR4的特異性shRNA雙鏈分子)、LPS+陰性對(duì)照組(在培養(yǎng)的HKC中加入50ng/ml的LPS的同時(shí)轉(zhuǎn)染非特異性的陰性對(duì)照的shRNA雙鏈分子)、正常組(不加LPS，也無轉(zhuǎn)染shRNA)；應(yīng)用免疫熒光染色在激光共聚焦顯微鏡下觀測(cè)TLR4的分布及表達(dá)強(qiáng)弱

17、；半定量RT-PCR和免疫蛋白印跡檢測(cè)TLR4及內(nèi)參照β-actin在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)量；Annexin V-FITC結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的早期凋亡率情況。
　　 結(jié)果：LPS+干擾組細(xì)胞中TLR4的免疫熒光強(qiáng)度明顯低于LPS組和LPS+陰性對(duì)照組，與正常組的TLR4免疫熒光強(qiáng)度相當(dāng)；LPS+干擾組細(xì)胞的TLR4 mRNA的光密度比值(0.198±0.041)明顯低于LPS組(0.445±0.049)和LPS+

18、陰性對(duì)照組(0.438±0.052)，與正常組無明顯差異(0.152±0.038)；LPS+干擾組細(xì)胞的TLR4蛋白的光密度比值(0.13±0.028)低于LPS組(0.307±0.035)和LPS+陰性對(duì)照組(0.283±0.032)，與正常組無明顯差異(0.098±0.018)；LPS+干擾組細(xì)胞的早期凋亡率(8.89[％])低于LPS組(43.57[％])和LPS+陰性對(duì)照組，與正常組細(xì)胞的早期凋亡率相當(dāng)。
　　 結(jié)論：采