Toll樣受體4在百草枯致小鼠急性多臟器功能損傷的作用.pdf

1、第一部分百草枯中毒致多臟器功能損傷小鼠模型的建立
　　目的：篩選合適的染毒劑量，建立百草枯中毒致多臟器功能損傷小鼠模型，初步探討百草枯中毒的劑量效應(yīng)規(guī)律，為后期實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。方法:30只清潔級(jí)C57BL/6小鼠隨機(jī)分為五組，每組6只。A組：20mg/kg百草枯染毒組，B組：40mg/kg百草枯染毒組，C組：60 mg/kg百草枯染毒組，D組：80mg/kg百草枯染毒組,E組：100mg/kg百草枯染毒組。百草枯溶液腹腔注射染毒后第3

2、天時(shí)計(jì)算各組死亡率，做HE染色觀察肝、腎、肺組織損傷情況。
　　結(jié)果：20mg/kg百草枯染毒組小鼠染毒后3天小鼠無(wú)死亡，40mg/kg百草枯染毒組小鼠染毒后3天小鼠死亡率為16.7％，60mg/kg百草枯染毒組3天小鼠死亡率為33.3%，80mg/kg百草枯染毒組3天小鼠死亡率為83.3%，100mg/kg百草枯染毒組3天小鼠死亡率為100%。從病理學(xué)改變看，60mg/kg百草枯染毒組小鼠有明顯的肺、肝、腎損傷，而40mg/kg

3、百草枯染毒組有明顯的肺損傷改變，肝腎損傷不明顯。
　　結(jié)論：C57BL/6小鼠給予腹腔注射百草枯60mg/kg即可造成明顯肝、腎、肺組織損害。并且隨著小鼠腹腔注射百草枯的劑量增大，其存活率逐漸降低。
　　第二部分 Toll樣受體4在百草枯致小鼠急性多臟器功能損傷的作用
　　目的：探討Toll樣受體4(Toll-like receptor4,TLR4)基因敲除對(duì)小鼠急性百草枯（PQ）中毒血清、肺組織炎癥指標(biāo)的影響，并且觀

4、察急性百草枯中毒后肝腎肺組織病理變化。
　　方法：野生型 C57BL小鼠和 Tlr4-/-C57BL小鼠分別隨機(jī)分為空白對(duì)照（NS）組，百草枯處理組。NS對(duì)照組給予生理鹽水60mg/kg腹腔注射，百草枯組給予百草枯60mg/kg腹腔注射。染毒后6h，24h，3d利用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE)染色法觀察小鼠肝腎肺組織病理改變，酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme linked immunosorbent assa

5、y，ELISA)法測(cè)定血清中白介素–6(interleukin–6，IL–6)和白介素–1β(interleukin–1sβ，IL-1β)水平，Real-time PCR法測(cè)定肺組織白介素–1β(interleukin–1β，IL-1β)，IL–6 mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：野生型PQ組小鼠PQ染毒6小時(shí)血清IL-6水平和肺組織IL-6 mRNA水平即明顯升高，第24小時(shí)和第3天繼續(xù)升高，各時(shí)間點(diǎn)IL-6水平都明顯高于NS組(

6、P<0.01)；Toll4-/-PQ組小鼠PQ染毒6小時(shí)、24小時(shí)、3天血清和肺組織IL-6水平均較野生型小鼠低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，Toll4-/-PQ組小鼠各時(shí)間點(diǎn)血清 IL-6水平高于 NS組（P<0.01），而肺組織第6小時(shí)、24小時(shí)IL-6水平與NS組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，第3天肺組織IL-6水平高于NS組（P<0.05）。野生型PQ組小鼠PQ染毒后肺血清及肺組織6小時(shí)、24小時(shí)、3天I

7、L-1β水平持續(xù)升高，各時(shí)間點(diǎn) IL-1β水平都高于 NS組(P<0.01)。Toll4-/-PQ組小鼠PQ染毒后第3天血清IL-1β水平較野生組小鼠明顯降低，而 Toll4-/-PQ組小鼠各時(shí)點(diǎn)肺組織IL-1βmRNA水平與野生型小鼠相比無(wú)明顯差異（p>0.05)。野生型PQ組小鼠至第3天時(shí)，肺泡腔塌陷、閉塞，肺泡間隔內(nèi)大量紅細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；出現(xiàn)明顯的肝血竇擴(kuò)張淤血，肝細(xì)胞呈水樣變性，有點(diǎn)片狀壞死；腎小球炎性細(xì)胞侵潤(rùn)及纖維素滲出明

8、顯，部分腎小管細(xì)胞出現(xiàn)壞死。Toll4-/-PQ組小鼠染毒第3天肺泡間隔內(nèi)大量紅細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)基本完整；肝細(xì)胞呈水樣變性，有點(diǎn)狀壞死；部分腎小球炎性細(xì)胞侵潤(rùn)及腎小管細(xì)胞壞死，肝腎基本結(jié)構(gòu)正常。
　　結(jié)論：TLR4基因敲除小鼠可以減少急性百草枯中毒后部分炎性因子血清 IL–6、IL–1β的釋放，并且肝、腎、肺組織的損害較野生型小鼠明顯減輕，延緩PQ導(dǎo)致的急性多臟器功能損傷的病理進(jìn)程。
　　第三部分高遷移率蛋白在小

9、鼠急性百草枯中毒致急性肺損傷中的表達(dá)研究
　　目的：本實(shí)驗(yàn)將在百草枯致小鼠急性多臟器功能損傷的模型上研究炎性因子高遷移率蛋白在血清中的含量變化和肺組織表達(dá)情況。
　　方法：野生型C57BL小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照（NS）組，百草枯處理組，NS對(duì)照組給予生理鹽水60mg/kg腹腔注射，百草枯組給予百草枯60mg/kg腹腔注射。染毒后6h，24h，3d利用免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry，IHC)染色方法觀察小

10、鼠肝腎肺組織病理改變，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定血清中高遷移率蛋白-1(high-mobility group box1，HMGB1)的含量，R-T PCR法測(cè)定肺組織高遷移率蛋白mRNA表達(dá)情況。
　　結(jié)果：與生理鹽水組小鼠比較，百草枯染毒組小鼠染毒后6小時(shí)血清血清HMGB1水平即出現(xiàn)較明顯的升高(P<0.05)，第24小時(shí)和第3天繼續(xù)升高，各時(shí)間點(diǎn)HMGB1水平都明顯高于NS對(duì)照組(P<0.05)，NS對(duì)照組、PQ6h、

11、PQ24h以及PQ3d各組間的血清HMGB1水平有明顯差異，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著(P<0.05)。百草枯染毒后6小時(shí)即有肺組織HMGB1-mRNA表達(dá)升高，第24小時(shí)肺組織HMGB1-mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，至染毒后第3天HMGB1-mRNA表達(dá)繼續(xù)增強(qiáng)。百草枯染毒組小鼠染毒后第24小時(shí)，肺泡上皮細(xì)胞和肺間質(zhì)炎性細(xì)胞核 HMGB1-表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，可見部分細(xì)胞胞漿、胞外呈陽(yáng)性，肺泡結(jié)構(gòu)仍保持較好的完整性；第3天肺泡結(jié)構(gòu)破壞、塌陷，上皮細(xì)胞和肺炎性