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文檔簡介
1、豬細小病毒(Porcine parvovirus,PPV)屬于細小病毒科細小病毒屬,是無囊膜的DNA病毒。PPV病毒感染能夠引起母豬繁殖障礙性疾病,造成母豬流產(chǎn)、胎兒畸形、木乃伊化及死亡等,給我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成巨大危害。PPV在大多數(shù)豬原代細胞和傳代細胞上均能增殖,并使細胞發(fā)生明顯病變,常作為模式病毒來探究病毒的感染機制和藥物的抗病毒機制。核轉錄因子-κB(nuclear transcription factor kappaB,NF-
2、κB)是細胞內重要的核轉錄因子,能夠調控多種炎性細胞因子、趨化因子等的轉錄,Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)能夠通過MyD88(Myeloid differentiation factor88)依賴途徑和MyD88非依賴途徑誘導NF-κB和TRAF6(TNF receptor associated factor-6)等基因活化,引起相關炎性細胞因子、趨化因子及干擾素等的合成與釋放,并在免疫應答反應中發(fā)揮
3、重要作用。本研究用豬腎傳代細胞(PK-15)作為細胞模型,首先研究了PPV感染細胞后TLR1-10的表達情況,然后研究了PPV感染PK-15細胞對NF-κB信號通路和免疫應答的影響,最后對TLR9在PPV感染細胞激活NF-κB信號通路中的功能進行研究,明確了TLRs在PPV感染PK-15細胞后誘導的天然免疫反應中的作用。研究內容如下:
1.根據(jù)GenBank中豬TLR1~10基因序列設計熒光定量PCR特異性引物,并檢測PPV感
4、染PK-15細胞后TLR1~10的轉錄規(guī)律。結果顯示,PPV感染PK-15細胞后,TLR1在PPV感染后3h表達上調,約為對照細胞的3.1倍,其他時段均低于正常水平;TLR3和TLR7mRNA表達水平在病毒感染早期均低于正常水平;TLR4和TLR8的mRNA均在感染后3、12和36h表達上調,TLR10分別在在3h和36h表達上調,其他時段均不同程度的降低;而TLR2和TLR9mRNA表達水平在感染后24h開始升高,并于48h達到峰值,
5、分別為空白水平的10.1倍和26.7倍。表明PPV感染PK-15細胞后能夠誘導細胞上TLR2和TLR9在mRNA水平顯著上調。
2.為研究PPV感染PK-15對NF-κB信號通路和免疫應答的影響,通過熒光定量PCR方法檢測PPV感染PK-15細胞后MyD88、TRAF6和NF-κB等通路相關因子及炎性細胞因子IL-6在mRNA水平的表達情況,同時利用ELISA方法檢測PPV感染后炎性細胞因子IL-6的變化規(guī)律。結果顯示,PPV
6、感染PK-15細胞后通路相關因子MyD88、IRAK1、TRAF6、TAK1α、IκBKB和NF-κB在感染后期表達量顯著升高;IL-6的mRNA和蛋白表達均在感染后36h達到峰值。以上結果表明PPV感染PK-15細胞后激活了NF-κB信號通路,并引起炎性因子的表達。
3.為進一步研究TLR9在TLRs-NF-κB信號通路介導的天然免疫反應中的作用,本研究利用TLR9抑制劑E6446二鹽酸鹽來研究TLR9在PPV感染PK-15
7、細胞激活NF-κB信號通路中的作用。結果顯示0.02μM和0.03μM E6446二鹽酸鹽能夠特異性抑制TLR9的表達,并引起IL-6的表達量下調;對不同時間段細胞分泌IL-6濃度研究顯示,E6446二鹽酸鹽處理的細胞IL-6的表達量在48h達到峰值,而PPV感染組細胞內IL-6的分泌在24h達到峰值。
本研究發(fā)現(xiàn)PPV感染PK-15細胞后能夠被TLR9識別,通過MyD88依賴途徑激活NF-κB,并調控炎性細胞因子IL-6的表
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