展示生長(zhǎng)抑素的豬細(xì)小病毒樣顆粒構(gòu)建及其免疫效力研究.pdf

1、豬細(xì)小病毒（Procineparvovirus，PPV）是引起母豬繁殖障礙的主要病原體之一，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。VP2是其主要衣殼蛋白，約占衣殼蛋白總量的80％，可誘導(dǎo)保護(hù)性中和抗體。VP2蛋白體外表達(dá)時(shí)可自主裝配成完整的病毒樣顆粒，同時(shí)也是構(gòu)建多價(jià)疫苗的良好載體。生長(zhǎng)抑素（somatostatin，SS）是下丘腦釋放的14肽激素，具有抑制生長(zhǎng)激素的分泌的生理功能。生長(zhǎng)抑素免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗體，通過(guò)中和SS進(jìn)而提高生長(zhǎng)激素水平促

2、進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。
　　 本文以豬細(xì)小病毒VP2蛋白為載體，在其N端插入4拷貝生長(zhǎng)抑素，用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得自我裝配的病毒樣顆粒，試圖獲得既可預(yù)防豬細(xì)小病毒病又能促進(jìn)生長(zhǎng)的嵌合疫苗。主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 1重組生長(zhǎng)抑素的豬細(xì)小病毒VP2基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及鑒定
　　 以PPVNJ-a株為模板擴(kuò)增VP2基因片段，人工合成4拷貝生長(zhǎng)抑素基因，克隆至桿狀病毒載體pFast-HTA，獲得重組質(zhì)粒pFast-SS4-V

3、P2。轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選三次后鑒定獲取陽(yáng)性重組Bacmid。Bacmid轉(zhuǎn)染sf-9細(xì)胞，出現(xiàn)病變后收毒鑒定，得到rBac-SS4-VP2。SDS-PAGE與Western-blot可見(jiàn)約68kDa的rSS4-VP2條帶；rBac-SS4-VP2感染細(xì)胞姒檢測(cè)產(chǎn)生很強(qiáng)的特異性綠色熒光；感染細(xì)胞超薄切片電鏡觀察到大量特征性病毒樣顆粒。
　　 2桿狀病毒表達(dá)SS4-VP2重組蛋白純化免疫原性初步鑒定
　　

4、 4周齡清潔級(jí)小鼠80只隨機(jī)分為9組：SS4-VP2/白油、SS4-VP2/鋁膠、SS4-VP2/IMS、SS4-VP2/鋁膠+CpG、SS4-VP2/IMS+CpG、rBacmid-SS4-VP2/鋁膠+CpG、PPVNJ-a滅活苗組、野生型桿狀病毒組和PBS組。重組蛋白的免疫劑量為50μg/只，桿狀病毒及豬細(xì)小病毒滅活疫苗免疫劑量為5×105TCID50/只，共免疫3次，免疫間隔2周。ELISA試劑盒檢測(cè)豬細(xì)小病毒抗體結(jié)果表明，重

5、組蛋白組與PPVNJ-a滅活苗組均產(chǎn)生特異性抗體，SS4-VP2/鋁膠組抗體水平最高，SS4-VP2/白油組最低，陰性對(duì)照組沒(méi)檢測(cè)到特異性抗體；利用PK-15細(xì)胞檢測(cè)PPV特異性中和抗體水平，中和抗體的滴度與ELISA檢測(cè)效價(jià)正相關(guān)，SS4-VP2/鋁膠組中和抗體效價(jià)最高；重組蛋白免疫組均產(chǎn)生較高滴度的抗生長(zhǎng)抑素抗體，同時(shí)，生長(zhǎng)激素水平提高了1倍左右。
　　 3豬細(xì)小病毒多抗的的制備
　　 利用PK-15細(xì)胞大量增殖豬細(xì)