VP22短肽融合豬細(xì)小病毒樣粒子的制備及免疫原性初步研究.pdf

1、豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起母豬繁殖障礙的主要病原之一，疫苗免疫仍是預(yù)防控制該病的主要手段。病毒樣粒子(Virus-likeparticles，VLPs)疫苗以其安全性高、免疫原性好成為各類病毒疫苗研究的熱門方向。PPV病毒樣粒子(PPV-VLPs)是不含PPV DNA的空衣殼結(jié)構(gòu)，由PPV VP2（下文簡稱:VP2）結(jié)構(gòu)蛋白體外自行組裝形成，形態(tài)上與天然病毒粒子相似，具有很強(qiáng)的免疫原性和生物學(xué)活性。

2、單純皰疹病毒1型(HSV-1)VP22蛋白是該病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，不僅具有細(xì)胞間自由轉(zhuǎn)運(yùn)的能力，而且還可以促進(jìn)融合抗原交叉致敏，增強(qiáng)免疫原性。此外，HSV-1 VP22（下文簡稱:VP22）蛋白還可能提高DNA疫苗的免疫反應(yīng)。
　　本研究分為三個(gè)部分，詳細(xì)研究內(nèi)容如下:
　　1、細(xì)胞穿膜肽VP22對(duì)生物膜穿透性的研究
　　以載體pEGFP-N1為模板擴(kuò)增增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因，通過SOE-PCR分別將VP22基

3、因片段拼接到EGFP基因的3'/5'端，獲得VP22-EGFP和EGFP-VP22融合基因;將融合基因及EGFP基因分別克隆到pET-28a(+)載體構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-EGFP-VP22、pET28a-VP22-EGFP和pET28a-EGFP，并進(jìn)行測(cè)序分析及酶切鑒定，將鑒定正確的各重組表達(dá)質(zhì)粒及pET-28a空載體分別轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE及Western Blot

4、分析結(jié)果可見相對(duì)分子量分別為約31 kDa、31 kDa及27 kDa的蛋白分子條帶，大小與預(yù)期相符，表明EGFP-VP22、VP22-EGFP、EGFP蛋白表達(dá)成功。對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行Ni-NTA親和層析純化，將純化后的蛋白添加到Vero細(xì)胞中進(jìn)行共培養(yǎng)，10h后熒光顯微鏡下觀察到加入VP22-EGFP和EGFP-VP22蛋白的細(xì)胞有綠色熒光，而加入EGFP的細(xì)胞與空白對(duì)照組細(xì)胞中則沒有觀察到綠色熒光存在，提示細(xì)胞穿膜肽VP22可有效攜

5、帶與其融合的EGFP蛋白穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，VP22蛋白融合到EGFP蛋白N端或C端并不影響VP22的穿膜效果。
　　2、VP22短肽融合豬細(xì)小病毒樣粒子的制備及鑒定
　　利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)進(jìn)行PPV VLPs的制備。以PPVN株的基因組為模板擴(kuò)增其VP2基因，通過SOE-PCR分別VP22基因拼接到VP2基因片段的3'/5'端，獲得VP22-VP2和VP2-VP22融合基因;將兩種融合基因及VP2

6、基因分別克隆到pFastBacTM1載體，獲得重組質(zhì)粒pFB-VP22-VP2、pFB-VP2-VP22及pFB-VP2。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行同源重組，獲得重組桿粒Bacmid-VP22-VP2、Bacmid-VP2-VP22及Bacmid-VP2。重組桿粒經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒株rBac-VP22-VP2、rBac-VP2-VP22及rBac-VP2。隨后將重組桿狀病毒株感染到sf9細(xì)胞進(jìn)行重

7、組蛋白的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot鑒定分析，結(jié)果可見相對(duì)分子量分別為約67 kDa、67 kDa及64 kDa的蛋白分子條帶，大小與預(yù)期相符，表明VP2-VP22、VP22-VP2及VP2蛋白表達(dá)成功。進(jìn)一步用PPV單抗對(duì)重組桿狀病毒感染細(xì)胞進(jìn)行IFA鑒定，可觀察到特異性熒光，再次證實(shí)重組蛋白的表達(dá)且具有生物活性。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)透射電鏡觀察，VP2和VP22-VP2均可自我組裝形成22-24nm、形態(tài)類似天然

8、PPV的病毒樣粒子;VP2-VP22沒有觀察到病毒樣粒子，表明VP2的N端融合VP22不影響VP2形成病毒粒子的特性，而C端融合外源蛋白可能影響VP2形成病毒樣粒子。
　　3、VP22短肽融合豬細(xì)小病毒樣粒子免疫原性的初步評(píng)價(jià)
　　用飽和硫酸銨法初步純化病毒樣粒子VP22-VP2(VLPs-VP22-VP2)、病毒樣粒子VP2(VLPs-VP2)及重組蛋白VP2-VP22，分別配以弗氏佐劑、ISA206佐劑及白油司本佐劑制成

9、疫苗免疫小鼠，并以PPV油乳滅活苗和PBS為對(duì)照，比較分析三種重組蛋白的免疫原性及篩選較好的免疫佐劑。通過間接ELISA檢測(cè)免疫小鼠血清中PPV特異性抗體，結(jié)果顯示VLPs-VP22-VP2及VLPs-VP2能有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性PPV抗體，其配以ISA206佐劑免疫產(chǎn)生的抗體水平與PPV滅活苗基本相當(dāng)，而重組蛋白VP2-VP22產(chǎn)生的抗體水平要明顯低于PPV滅活苗組;IL-2是T細(xì)胞增殖的主要生長因子，IFN-γ僅由活化T細(xì)胞和自然

10、殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)產(chǎn)生，檢測(cè)這兩個(gè)指標(biāo)的不同程度能反映動(dòng)物機(jī)體的細(xì)胞免疫水平，對(duì)采集的免疫小鼠血清IL-2和IFN-γ含量測(cè)定結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，VLPs-VP22-VP2、VLPs-VP2及重組蛋白VP2-VP22免疫組均能有效刺激IL-2和IFN-γ的產(chǎn)生，且融合VP22的VLPs-VP22-VP2刺激機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ和IL-2的水平顯著高于VLPs-VP2及PPV滅活苗(P＜0.05)，此外，以ISA206為佐劑，其免