流感病毒誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的病理變化及天然免疫反應(yīng).pdf

1、研究目的與意義:
　　流感病毒感染可引起人呼吸系統(tǒng)疾病,同時(shí)亦可感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS),導(dǎo)致部分感染人群產(chǎn)生CNS病變。在流感相關(guān)性腦病與腦炎綜合征病人的腦脊液中促炎癥細(xì)胞因子濃度出現(xiàn)異常升高。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞是CNS細(xì)胞因子產(chǎn)生的主要來(lái)源,但其在流感病毒感染CNS時(shí)的功能仍不清楚。因此,探索小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞在流感病毒感染后所發(fā)生的病理變化及免疫反應(yīng),為明確膠質(zhì)細(xì)胞在感染中的作用、理解CNS

2、感染流感病毒后的發(fā)病機(jī)制提供必要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　此外,根據(jù)人流感病毒基因組核酸的類(lèi)型、進(jìn)化趨勢(shì)及預(yù)實(shí)驗(yàn)的線索,推測(cè)流感病毒與APOBEC家族蛋白存在可能的潛在相關(guān)性。探尋APOBEC與流感病毒復(fù)制及突變的關(guān)系,為尋找對(duì)流感病毒具有潛在抑制作用的因子、理解病毒進(jìn)化因素提供新的思路。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.明確病毒遺傳背景、建立反向遺傳平臺(tái):選取人A/Shantou/169/2006(H1N1)和禽A/Chicken/

3、Guangdong/1/05(H5N1)流感病毒,對(duì)病毒全基因組進(jìn)行克隆測(cè)序,構(gòu)建反向遺傳通用載體及含上述兩種病毒全基因組片段的質(zhì)粒;
　　2.探討膠質(zhì)細(xì)胞感染流感病毒后的病理變化和免疫反應(yīng):分離培養(yǎng)小鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,檢測(cè)流感病毒受體;使用遺傳背景明確的H1N1和H5N1感染小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞,檢測(cè)病毒復(fù)制、病毒生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞病變、細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白分泌變化;使用人膠質(zhì)細(xì)胞,檢測(cè)流感病毒感染后APOBEC家族基因轉(zhuǎn)錄

4、水平變化;
　　3.探討APOBEC家族蛋白與流感病毒復(fù)制及突變頻率的關(guān)系:克隆APOBEC家族成員并構(gòu)建MDCK表達(dá)細(xì)胞系,檢測(cè)流感病毒在APOBEC表達(dá)細(xì)胞上的復(fù)制效率與突變頻率。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.完成了人H1N1和禽H5N1流感病毒的純化培養(yǎng)及基因組的克隆與測(cè)序;
　　2.成功構(gòu)建了CMV及Pol I雙向啟動(dòng)子的反向遺傳載體,及兩株流感病毒全基因組反向遺傳質(zhì)粒;
　　3.親和熒光實(shí)驗(yàn)表明小鼠膠

5、質(zhì)細(xì)胞存在禽及人流感病毒受體 SA-α2,3-Gal和SA-α2,6-Gal;
　　4.小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞均可被流感病毒感染并產(chǎn)生子代病毒。小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)流感病毒的敏感性和復(fù)制效率高于星形膠質(zhì)細(xì)胞,H1N1復(fù)制效率高于H5N1;
　　5.流感病毒感染膠質(zhì)細(xì)胞可產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,小膠質(zhì)細(xì)胞的CPE和凋亡率高于星形膠質(zhì)細(xì)胞:
　　6.流感病毒感染可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的促炎癥細(xì)胞因子

6、(IL-1α、IL-1β、IL-6及TNF-α)及趨化因子(CCL-2、-3、-5及CXCL-2、-9、-10)的mRNA水平上調(diào);H5N1的感染能誘導(dǎo)更強(qiáng)烈的上調(diào)反應(yīng);
　　7. ELISA結(jié)果表明,小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞在流感病毒感染后,促炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌量上調(diào);H5N1的感染能誘導(dǎo)更強(qiáng)烈的上調(diào)反應(yīng);
　　8.小鼠膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)APOBEC3,人膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)APOBEC-3B、-3C、-

7、3F和-3G,在流感病毒感染后,其轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生上調(diào);
　　9.克隆并表達(dá)了人APOBEC-1、-2、-3A、-3B、-3C、-3F、-3G、-3H、-4和AID,小鼠APOBEC-3和大鼠APOBEC-1,其中hA3F和hA3G構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系;
　　10.在證實(shí)hA3F和hA3G的表達(dá)不受流感病毒封閉,且具有抑制HBV復(fù)制活性的情況下,表明 hA3F和hA3G對(duì)流感病毒的復(fù)制效率及基因突變頻率無(wú)明顯作用;其它APOB

8、EC家族成員尚未發(fā)現(xiàn)具有明顯抑制流感病毒復(fù)制的潛力。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建了反向遺傳通用載體及兩株流感病毒的全基因組反向遺傳質(zhì)粒;
　　2.小鼠膠質(zhì)細(xì)胞表面存在人流感病毒受體 SA-α2,6-Gal及禽流感病毒受體SA-α2,3-Gal,人及禽流感病毒均可感染小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞,并進(jìn)行有效復(fù)制產(chǎn)生具有感染性的子代病毒;
　　3.流感病毒的感染可對(duì)小鼠膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生以CPE和凋亡為特征的直接損傷作用