IL-2對宿主感染異型流感病毒適應(yīng)性細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的影響.pdf

1、目的：
　　 流行性感冒病毒(Influenza virus,簡稱流感病毒),屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)。流感病毒呈球形,新分離的毒株則多呈絲狀,其基因為分節(jié)段的負鏈RNA,根據(jù)病毒核衣殼蛋白(Nucleoprotein,NP)和基質(zhì)蛋白(Matrix,M)的不同,可分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三種型別。甲型流感病毒根據(jù)病毒表面血凝素(Hemagglutinin,HA)抗原的不同分為16個HA亞型,根

2、據(jù)神經(jīng)氨酸(Neuraminidase,NA)的抗原不同,分為9個NA亞型。流感病毒的HA和NA易發(fā)生變異,變異有兩種形式:抗原漂移(Antigenic drift)和抗原轉(zhuǎn)換(Antigenic shift),抗原漂移引起局部中小型流感流行;但抗原轉(zhuǎn)換變異幅度大,每次變異都會導致新的亞型出現(xiàn),由于人群對新亞型完全沒有免疫力,每次抗原轉(zhuǎn)換都曾引起世界性流感爆發(fā)流行,1918～1919年的大流行中,全世界至少有2000萬人死于流感,自19

3、97年以后H1N1亞型與H3N2亞型交替在人群中流行,并出現(xiàn)H5N1型禽流感病毒感染人的病例,對人類的健康造成很大的威脅。
　　 目前使用的疫苗只對疫苗所含型別有效,往往是通過產(chǎn)生血凝素抗體達到預防流感病毒感染的目的,對變異株無效。研究人員已開始考慮能否通過提高細胞免疫的方法,達到預防異型流感病毒感染的目的。哪種細胞免疫反應(yīng)在抗異型流感病毒免疫中起主要作用?其機制是什么?目前無統(tǒng)一的結(jié)論。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn),應(yīng)用IL-2可以增

4、強機體抗異型流感病毒的作用。為了探討其機制,我們在應(yīng)用IL-2后,對相關(guān)細胞因子及T淋巴細胞水平進行了檢測,為開發(fā)以細胞免疫為基礎(chǔ)的具有交叉免疫保護作用的流感病毒疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 一、病毒滴度測定
　　 將A/FM/47(H1N1)流感病毒株的病毒儲存液用PBS溶液進行10倍等比稀釋(10-1·10-10),把各稀釋液分別接種于9日齡雞胚尿囊腔中,37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),根據(jù)Reed-Mue

5、nch方法,計算雞胚半數(shù)感染量。
　　 二、動物分組
　　 取6～8周齡雌性SPF級C57BL/6小鼠90只,隨機分為實驗組和對照組,實驗1組(異型免疫組):用H5N1型流感病毒免疫,H1N1型流感病毒感染;實驗2組(異型免疫加強組):用H5N1型流感病毒免疫,再次免疫的同時使用IL-2,最后進行H1N1型流感病毒感染:對照1組(未免疫病毒感染對照組):未免疫,直接感染H1N1型病毒;對照2組(單純使用IL-2組):只用

6、IL-2后感染H1N1型流感病毒;對照3組(IL-2對照組):只使用IL-2,不感染。對照4組(空白對照組):正常飼養(yǎng),不做任何處置。
　　 三、免疫動物
　　 選用H5N1型流感病毒疫苗按上述分組免疫動物,疫苗接種按說明書進行。首次免疫三周后加強免疫一次,方法劑量同上。再次免疫時,使用IL-2組的小鼠,經(jīng)腹腔注射IL-2,連續(xù)注射0,1,2天。
　　 四、感染動物
　　 加強免疫兩周后,按上述分組每只小

7、鼠經(jīng)鼻腔感染H1N1型流感病毒。正常飲食飲水飼養(yǎng),感染病毒后每天準確稱量小鼠體重,觀察飲食飲水及精神狀態(tài)。
　　 五、存活率和肺指數(shù)
　　 小鼠感染流感病毒后觀察其存活情況,記錄每組死亡數(shù),計算各組存活率;無菌解剖取小鼠全肺稱重,并計算肺指數(shù)。
　　 六、細胞因子水平測定
　　 分別于感染前、感染7天后無菌解剖取小鼠全肺,按常規(guī)方法制作肺組織勻漿,-20℃保存待測。ELISA試劑盒測定感染前后細胞因子IL

8、-2、IL-4、IL-10、IFN-γ含量,具體操作按試劑盒說明書進行,酶標儀測OD450值,計算細胞因子含量(pg/ml)。
　　 七、CD4+T、CD8+T細胞水平測定
　　 (一)小鼠肺中CD4+T、CD8+T細胞水平測定
　　 分別于感染前、感染5天、7天后無菌解剖取小鼠全肺,稱重后制作小鼠肺組織單細胞懸液,細胞分組,孵育抗體,用流式細胞儀檢測CD4+T、CD8+T細胞的百分含量。
　　 (二)小

9、鼠脾中CD4+T、CD8+T細胞水平測定
　　 取肺的同時取脾,制作小鼠脾單細胞懸液,方法同上,用流式細胞儀檢測CD4+T、CD8+T細胞的百分含量。
　　 結(jié)果：
　　 一、感染病毒滴度測定
　　 根據(jù)Reed-Muench方法,計算EID50為104.8。
　　 二、一般情況及肺指數(shù)
　　 (一)感染H1N1流感病毒后小鼠死亡情況:
　　 實驗1組(異型免疫組)小鼠死亡4只,生

10、存率為67%;實驗2組(異型免疫加強組)小鼠全部存活;對照1組(未免疫病毒感染對照組)小鼠全部死亡。
　　 (二)肺指數(shù):
　　 實驗1組(異型免疫組)為0.882%;實驗2組(異型免疫加強組)為0.75%;對照1組(未免疫病毒感染對照組)肺指數(shù)最大為1.5%;對照2組(單純IL-2免疫組)為1.02%,其余各組均差異不大。
　　 三、Elisa試劑盒檢測細胞因子含量
　　 感染病毒5天、7天后,實驗1組

11、(異型免疫組)和實驗2組(異型免疫加強組),細胞因子IFN-γ含量明顯高于感染前;實驗2組(異型免疫加強組)細胞因子IFN-γ含量明顯高于實驗1組(異型免疫組),(P＜0.05)差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 四、流式細胞儀測定CD4+T、CD8+T細胞百分比含量
　　 感染病毒后5天、7天,實驗1組(異型免疫組)和實驗2組(異型免疫加強組)小鼠肺和脾內(nèi)CD4+T細胞和CD8+T細胞含量明顯高于感染前;但實驗1組(異型免疫組

12、)與實驗2組(異型免疫加強組)比較無顯著差異。
　　 結(jié)論：
　　 1、IL-2可以增強小鼠抗異型流感病毒感染作用,提高小鼠異型流感病毒感染后的生存率。
　　 2、使用IL-2異型加強組細胞因子IFN-γ含量明顯高于感染前、高于異型組(P＜0.05)差異具有統(tǒng)計學意義。說明IFN-γ與異型流感病毒感染免疫應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)。
　　 3、免疫小鼠異型流感病毒感染后CD4+T與CD8+T細胞百分比明顯高于感染前(P