鴨坦布蘇病毒誘導的宿主天然免疫反應及與RLR信號通路的互作研究.pdf

1、鴨坦布蘇病毒（duck Tembusu virus,DTMUV）是一種有囊膜的，單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科黃病毒屬。DTMUV于2010年首先在福建、浙江等地的發(fā)病鴨場中分離到，主要引起產(chǎn)蛋鴨群產(chǎn)蛋下降、商品肉鴨生長遲緩和神經(jīng)癥狀。該病傳播迅速，給我國養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。
　　宿主天然免疫反應在病原微生物感染早期發(fā)揮重要作用，模式識別受體（pattern recognition receptors,PRRs）作為宿主

2、天然免疫系統(tǒng)的關鍵組成元件，主要識別病原微生物的保守成分。RIG-I樣受體（RIG-I like receptor,RLR）是主要分布于非免疫細胞中的一類胞漿PRRs，包含維甲酸誘導基因I（retinoic acid induced gene-I,RIG-I）、黑色素瘤分化相關基因（melanoma differentiation associated gene5,MDA5）以及遺傳和生理學實驗基因2（laboratory of gen

3、etics and physiology-2,LGP2），主要識別RNA病毒，通過接頭分子線粒體抗病毒信號蛋白（mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS），啟動下游信號級聯(lián)反應，合成一系列的細胞因子，如I型干擾素和炎性細胞因子等，使宿主建立抗病毒天然免疫狀態(tài)。目前，對DTMUV的致病性還不清楚，DTMUV感染后誘導的宿主天然免疫反應以及RLR在病毒感染過程中的作用更是缺乏了解。本研究以

4、櫻桃谷雛鴨為實驗動物，通過病理組織學分析、熒光定量PCR等方法，首先觀察DTMUV對不同日齡櫻桃谷鴨的致病性差異，以及感染后誘導的天然免疫反應，然后使用過表達、RNA干擾和雙熒光素酶報告基因檢測等方法對RIG-I、MDA5和MAVS在病毒感染過程中的作用進行分析，初步探討了DTMUV對RLR信號通路的抑制作用。研究內容主要分為以下四個方面：
　　1.DTMUV對不同日齡櫻桃谷鴨的致病性研究
　　1、3和7周齡的櫻桃谷鴨通過腿

5、部肌肉注射途徑感染DTMUV，然后觀察感染鴨的臨床癥狀、病理組織學變化、組織含毒量以及血清中和抗體等變化規(guī)律。結果發(fā)現(xiàn)，1周齡雛鴨在感染后第2天出現(xiàn)明顯的以神經(jīng)紊亂為主的臨床癥狀，在感染后第5-7天，部分感染鴨死亡。3周齡感染鴨表現(xiàn)類似但程度較輕的臨床癥狀，且未見死亡。而7周齡感染鴨僅出現(xiàn)一過性的食欲減退。實驗鴨主要組織的病變程度隨著感染日齡的增大而逐漸減輕。1周齡感染鴨出現(xiàn)明顯的心內膜出血、脾腫大，回腸淋巴組織集中處黏膜腫脹，肝、腎腫

6、脹且有出血，腦膜充血。3周齡感染鴨的病變程度較輕微，7周齡鴨則未見明顯的眼觀病變。但是，病理組織學分析顯示，三組感染鴨均呈現(xiàn)典型的病毒性腦炎病變。組織中病毒含量檢測發(fā)現(xiàn)，感染后第1天，DTMUV即能在1周齡感染鴨的大腦中檢測到，感染后第3-5天，1周齡鴨的主要組織含毒量均顯著高于另外兩組感染鴨對應組織的含毒量（P＜0.05）。感染鴨血清中IFN-γ、IL-2及中和抗體的含量呈相似性變化，但1周齡鴨與另外兩組鴨存在顯著性差異（P＜0.05

7、）。更重要的是，盡管各組實驗鴨的血清中和抗體在DTMUV感染后第7-19天無顯著差異，但是1周齡鴨的病毒清除速度卻顯著慢于3、7周齡鴨，表明與鴨日齡相關的自身免疫系統(tǒng)即天然免疫在感染早期清除病毒的過程中發(fā)揮關鍵作用?？偟膩碚f，本部分研究證實DTMUV對不同日齡鴨的致病性不同，日齡越小致病性越強，與日齡相關的免疫反應能力對DTMUV的致病性具有重要影響。
　　2.DTMUV感染雛鴨和鴨胚成纖維細胞（DEFs）后誘導的天然免疫反應

8、r>　　為確定DTMUV感染后誘導的天然免疫反應，我們通過相對熒光定量PCR檢測了病毒感染1周齡雛鴨脾和腦組織中天然免疫相關基因的變化。結果顯示，在DTMUV感染的早期階段，病毒能顯著上調RIG-I、MDA5和TLR3的表達（P＜0.05），說明這些PRRs參與DTMUV感染后誘導的天然免疫反應。同時，炎性細胞因子（IL-1β、L-2、IL-6和IL-8）和抗病毒蛋白（Mx、OAS等）也大量表達，其中IL-6表達量的增加最為顯著。在感染

9、鴨的脾和腦中，I型和II型IFNs的變化不同。在脾中，兩種類型IFNs均呈現(xiàn)不同程度的上調，但是在腦中，二者變化趨勢差異較大。除此之外，我們還檢測了DTMUV體外感染DEFs后RIG-I、MDA5、I型IFNs和部分促炎細胞因子的表達變化，結果與體內實驗類似，RIG-I和MDA5被病毒激活而過量表達，導致IFN-α和IFN-β、抗病毒蛋白OAS以及IL-6、IL-8等的大量表達。上述研究結果說明，DTMUV感染雛鴨和DEFs后其抗病毒天

10、然免疫反應被迅速激活，但仍不足以抵抗病毒短時間內快速、大量的增殖，同時，促炎細胞因子如IL-6等的大量產(chǎn)生亦能對宿主自身造成一定的免疫損傷，從而加重病情。
　　3.RIG-I和MDA5參與宿主的抗DTMUV感染
　　為了進一步明確RIG-I和MDA5在抗DTMUV感染過程中的作用，使用過表達和雙熒光素酶報告基因檢測等技術分析了病毒感染DEFs后二者介導的IFN-β的產(chǎn)生情況。首先通過前期的實驗，我們發(fā)現(xiàn)DTMUV能誘導RIG

11、-I、MDA5、MAVS和IFN-β在mRNA水平上顯著上調。進一步地，先在DEFs上分別過表達RIG-I和MDA5的全長及其效應結構域，再感染DTMUV，發(fā)現(xiàn)兩個受體及其效應結構域均能抑制DTMUV增殖。繼而，我們克隆并表達了鴨MAVS基因（duMAVS），通過過表達和RNA干擾證實，duMAVS在DTMUV感染過程中是必須的。此外，DTMUV感染后能進一步刺激RIG-I和MDA5誘導的轉錄因子NF-κB和IRF-7的產(chǎn)量，說明過表達

12、的RIG-I和MDA5識別DTMUV核酸后能通過 NF-κB和 IRF-7信號通路激活下游IFN-β。本部分研究初步確定RIG-I/MDA5-MAVS-IRF-7/NF-κB信號通路介導IFN-β參與抗DTMUV的天然免疫反應。
　　4.DTMUV的非結構蛋白NS1抑制RIG-I和MDA5介導的信號通路
　　前期發(fā)現(xiàn)預先感染了DTMUV的細胞，再次經(jīng)RIG-I或MDA5刺激后，其誘導的IFN-β表達量顯著低于對照組細胞，提示

13、DTMUV對RIG-I和MDA5介導的IFN-β的產(chǎn)生存在一定的抑制作用。為了進一步明確DTMUV通過何種方式拮抗宿主IFN-β的產(chǎn)生，我們分別克隆并構建了病毒7個非結構蛋白NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5的真核表達質粒，實驗發(fā)現(xiàn)，過表達有NS1蛋白的細胞中IFN-β含量較對照組顯著下降，表明DTMUV的NS1蛋白在拮抗RIG-I和MDA5的信號通路中起主要作用。進一步地，將NS1和duMAVS的真核表達質