血小板Toll樣受體4調(diào)控脂多糖誘導的血小板一氧化氮合成.pdf

1、研究背景:
　　 血小板是血液循環(huán)中最小的無核細胞，活化后具有粘附、聚集、分泌等生理功能，在止血與血栓形成過程中發(fā)揮重要作用。近年來，越來越多的證據(jù)顯示，血小板除了上述傳統(tǒng)的生理功能外，還是一種炎癥細胞，合成和分泌多種炎性介質(zhì)參與機體炎癥性疾病的過程。
　　 最早提出血小板與炎癥關(guān)系是建立在動脈粥樣硬化研究的基礎上，血小板通過釋放血小板因子-4(PF4)、白細胞介素-1β(IL-1β)、RANTES等炎性因子主動參與動脈

2、粥樣硬化的全過程。隨后，膿毒癥患者血小板數(shù)目的減少被認為與細菌內(nèi)毒素誘導血小板活化，分泌大量的炎癥介質(zhì)，如TNF-α、IL-1β等有關(guān)，說明血小板在感染性炎癥的發(fā)病中也扮演著重要角色。
　　 Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是一種模式識別受體(patternrecognition receptors,PRRs)，有13種亞型(TLR1～TLR13)，能夠辨別病原相關(guān)分子模式(pathogen-ass

3、ociated molecule pattern,PAMPs)，在機體識別微生物的天然免疫過程中發(fā)揮重要作用，其中針對革蘭氏陰性細菌的主要是TLR4。脂多糖(LipopolySaccharide，LPS)，即細菌內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成份和最重要的致病因子，TLR4是它的特異性受體。2005年，Andonegui第一次證實了血小板表達功能性的TLR4，隨后發(fā)現(xiàn)血小板TLR4能夠介導LPS誘導的血小板活化，促進血小板分泌大量

4、的炎癥因子及氧化應激物。
　　 一氧化氮(Nitrc Oxide，NO)屬于氮氧化物家族，是一種具有重要生理功能的氣體和自由基。NO由L-精氨酸在一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase,NOS)的催化下合成。NOS具有三種亞型，即神經(jīng)元型NOS(Neuronal NOS，nNOS)、誘導型NOS(Inducible NOS，iNOS)和內(nèi)皮型NOS(Endothelial NOS，eNOS)。NO合成后，促進可

5、溶性鳥苷環(huán)化酶(soluble guanylyl cyclase，sGC)生成環(huán)磷鳥苷(cyclic GMP，cGMP)，而cGMP作為第二信使激活細胞內(nèi)的信號傳導系統(tǒng)，改變細胞的生物學活性。已有研究表明，血小板表達iNOS和eNOS，LPS能夠誘導血小板iNOS的表達從而增加NO的合成。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)血小板eNOS—mRNA水平和NO量與動脈粥樣硬化斑塊形成有關(guān)；但LPS誘導血小板活化與eNOS的關(guān)系結(jié)論不肯定。
　　 本

6、實驗通過觀察LPS作用前后TLR4、CD62P、eNOS/NO的表達水平以及它們之間的關(guān)系，探討TLR4在LPS誘導的血小板活化及NO合成中的地位，并對NOS系統(tǒng)在其中的作用進行初步的探索。
　　 實驗目的:
　　 觀察LPS作用前后血小板TLR4和CD62P的表達，闡明TLR4在血小板活化中的作用；同時檢測血小板活化前后NO濃度，以明確TLR4在LPS誘導的血小板NO合成中所起的作用；進一步研究血小板eNOS與NO合成

7、的關(guān)系，探討LPS誘導血小板參與炎癥過程的可能機制。
　　 方法:
　　 1.標本來源
　　 健康獻血員(25歲-52歲)，性別不限，無糖尿病、原發(fā)性高血壓、血脂異常，無感染性疾病、慢性心肺疾病，無長期使用避孕藥及吸煙史。抽血前30天內(nèi)未服用阿司匹林、波立維、華法令等影響血小板及凝血功能的藥物。
　　 2.觀察內(nèi)容
　　 1)不同濃度LPS作用前后血小板TLR4、CD62P的表達。
　　

8、2)不同濃度LPS作用前后血小板eNOS/NO的表達。
　　 3)抑制eNOS后LPS誘導血小板NO的合成及TLR4的表達。
　　 4)阻斷TLR4后LPS誘導血小板NO的合成及eNOS的表達。
　　 3.實驗方法
　　 1)分組：①正常對照組(C組)；②凝血酶0.02U/ml組(T組)；③LPS1.0μgml組(L1組)；④LPS5.0μg/m組(L5組)；⑤LPS10.0μg/m組(L10組)；⑥L-

9、NAME100μM組(N組)；⑦TRL4mAb1.0μg/ml組(B組)；⑧LPS1.0μg/ml+L-NAME100μM組(L+N組);⑨LPS1.0μg/ml+TLR4mAb1.0μgml組(L+B組)。以上各組在37C溫箱孵育30分鐘后進行各項相關(guān)檢測。
　　 2)血小板TLR4蛋白的表達：①流式細胞術(shù)法(Flow cytometry,FCM)；②Western Blot法。
　　 3)血小板TLR4 mRNA的表

10、達：RT-PCR法(Reverse transcription polymerasechain reaction，RT-PCR)。
　　 4)血小板CD62P的表達：FCM法
　　 5)血小板eNOS蛋白的表達：Western Blot法
　　 6)血小板eNOS mRNA的表達：RT-PCR法
　　 7)血小板NO的濃度：硝酸還原酶法
　　 4.統(tǒng)計分析
　　 1)采用SPSS16.0統(tǒng)

11、計軟件，檢驗水準定為P≤0.05。
　　 2)計量資料的描述用均數(shù)±標準差(X±s)表示。
　　 3)兩獨立樣本均數(shù)的t檢驗。
　　 4)多組均數(shù)比較的方差分析。
　　 5)變量間的相關(guān)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.血小板TLR4的表達：FCM檢測LPS作用前后血小板TLR4蛋白的表達率為
　　 12.42±1.68％(C組)、19.47±0.05％(L1組)、33.5±4.76

12、％(L5組)和32.94±0.69％(L10)組;Western Blot檢測LPS作用前后血小板TLR4蛋白表達率為27.8±0.4％(C組)、38±0.7％(L1組)、39.8±0.5％(L5組)和39.4±0.5％(L10組)。對照組與各實驗組差異均有統(tǒng)計學意義，L5和L10組間差異無統(tǒng)計學意義。血小板能檢測到TLR4mRNA，但各實驗組與正常對照組之間差異無統(tǒng)計學意義。
　　 2.血小板CD62P的表達：FCM檢測LPS

13、作用前后血小板CD62P的表達率為0.24±0.07％(C組)、8.99±2.2％(L1組)、32.4±1.89％(L5組)和35.25±0.04％(L10組)。各實驗組與正常對照組差異有統(tǒng)計學意義，L5和L10組間差異無統(tǒng)計學意義。
　　 3.血小板eNOS的表達：Western Blot檢測eNOS蛋白和RT-PCR檢測eNOSmRNA在血小板均有表達，但各組之間差異無統(tǒng)計學意義。
　　 4.NO濃度測定：硝酸還原酶

14、法檢測NO的濃度分別為1.16±1.14μM(C組)、19.33±3.41μM(T組)、12.51±3.01μM(L1組)、29.55±3.01μM(L5組)、22.73±4.10μM(L10)組、1.5±0.6μM(N組)、0.78±0.66μM(B組)、7.21±1.74μM(L+N組)和6.65±1.31μM(L+B組)。LPS各濃度誘導組及T組與C組比較差異有統(tǒng)計學意義，LPS各濃度組之間差異有統(tǒng)計學意義。N組和B組與正常對照組

15、比較差異無統(tǒng)計學意義，L+N組和L+B組NO的合成量低于L1組，但高于C組，差異有統(tǒng)計學意義。
　　 5.線性相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，血小板TLR4的表達與CD62P表達率呈正相關(guān)關(guān)系;血小板TLR4的表達與NO合成呈正相關(guān)關(guān)系。
　　 結(jié)論:
　　 1.LPS誘導血小板TLR4的表達和血小板活化
　　 2.LPS能夠誘導血小板NO的合成，但不影響eNOS表達
　　 3.LPS誘導血小板活化和血小板NO的合