脂多糖-肽聚糖誘導(dǎo)人血小板凋亡的體外研究.pdf

1、研究目的：
　　本研究擬通過(guò)制備人的洗滌血小板，并在TLR4/TLR2單克隆抗體阻斷前后分別給予LPS/PGN刺激，初步探討體外條件下LPS/PGN對(duì)血小板凋亡的誘導(dǎo)效應(yīng)及LPS-TLR4、PGN-TLR2通路在其中發(fā)揮的作用，為膿毒癥相關(guān)性血小板減少癥的發(fā)病機(jī)制提供基礎(chǔ)研究證據(jù)，為改善膿毒癥相關(guān)性血小板減少癥患者的預(yù)后提供可能的治療靶點(diǎn)。
　　內(nèi)容：
　　第一部分：體外條件下，LPS誘導(dǎo)人血小板凋亡的研究及TLR4的

2、介導(dǎo)作用
　　制備人洗滌血小板，濃度梯度組用不同濃度的LPS分別與洗滌血小板進(jìn)行體外孵育，觀(guān)察LPS對(duì)血小板凋亡的誘導(dǎo)效應(yīng)并篩選出誘導(dǎo)血小板凋亡的LPS最適濃度。TLR4單克隆抗體阻斷組以凝血酶為陽(yáng)性對(duì)照，觀(guān)察TLR4單克隆抗體阻斷前后，LPS對(duì)血小板凋亡誘導(dǎo)作用的變化。
　　第二部分：體外條件下，PGN誘導(dǎo)人血小板凋亡的研究及TLR2的介導(dǎo)作用
　　制備人洗滌血小板，濃度梯度組用不同濃度的PGN分別與洗滌血小板進(jìn)行體

3、外孵育，觀(guān)察PGN對(duì)血小板凋亡的誘導(dǎo)效應(yīng)并篩選出誘導(dǎo)血小板凋亡的PGN最適濃度。TLR2單克隆抗體阻斷組以凝血酶為陽(yáng)性對(duì)照，觀(guān)察TLR2單克隆抗體阻斷前后，PGN對(duì)血小板凋亡誘導(dǎo)作用的變化。
　　方法：
　　制備洗滌血小板，建立體外反應(yīng)體系，分別設(shè)置LPS/PGN濃度梯度實(shí)驗(yàn)組及TLR4/TLR2單克隆抗體阻斷實(shí)驗(yàn)組，以凝血酶誘導(dǎo)的血小板凋亡作為陽(yáng)性對(duì)照，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定不同處理組血小板的PS外翻及ΔΨ去極化，應(yīng)用凋亡蛋

4、白抗體芯片法篩查血小板凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，應(yīng)用蛋白印記技術(shù)檢測(cè)促凋亡蛋白Caspase-3、-8、Bax、Bak和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　LPS及PGN均以濃度依賴(lài)性為特點(diǎn)誘導(dǎo)血小板發(fā)生PS外翻及ΔΨ去極化。凋亡蛋白抗體芯片結(jié)果顯示，在LPS及PGN刺激下，血小板多種凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)生變化，主要以促凋亡蛋白的升高及抗凋亡蛋白的降低為主。Western Blot結(jié)果提示 LPS及 PGN誘導(dǎo)下

5、，血小板促凋亡蛋白 Caspase-3、-8、Bax及Bak的表達(dá)增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)也呈增高趨勢(shì)。而TLR4/TLR2單克隆抗體阻斷實(shí)驗(yàn)表明，LPS-TLR4/PGN-TLR2通路至少部分介導(dǎo)了LPS/PGN誘導(dǎo)的血小板凋亡的發(fā)生。
　　結(jié)論：
　　1. LPS及PGN均可誘導(dǎo)血小板發(fā)生凋亡，表現(xiàn)為PS外翻、ΔΨm去極化、Caspase-3活性增高、Caspase-8、Bak、Bax及Bcl-2等凋亡相關(guān)蛋白表