細(xì)菌性脂多糖誘導(dǎo)骨細(xì)胞凋亡及釋放HMGB1.pdf

1、背景和目的：
　　 骨細(xì)胞是骨組織中含量最多且生存時(shí)間最長(zhǎng)的細(xì)胞類(lèi)型。近年來(lái)的研究表明，骨細(xì)胞不是單純的沉默細(xì)胞。這些骨細(xì)胞通過(guò)骨小管相互聯(lián)系，在骨組織中形成密集的三維網(wǎng)絡(luò)，感知機(jī)械力、激素、炎癥因子等因素的變化，并且將這些變化信號(hào)通過(guò)骨小管傳遞給周?chē)墓羌?xì)胞以及骨內(nèi)表面的骨內(nèi)襯細(xì)胞，成骨細(xì)胞以及破骨細(xì)胞等，從而對(duì)刺激做出相應(yīng)的反應(yīng)。體內(nèi)外研究表明，骨細(xì)胞的活性對(duì)破骨細(xì)胞的生成和功能狀態(tài)有重要的調(diào)控作用，骨細(xì)胞在某些病理因素的作

2、用下會(huì)發(fā)生凋亡，凋亡的骨細(xì)胞又會(huì)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞性骨吸收。骨細(xì)胞凋亡的信號(hào)如何傳遞給破骨細(xì)胞前體細(xì)胞及成熟的破骨細(xì)胞？長(zhǎng)期以來(lái)，由于骨細(xì)胞難以分離、培養(yǎng)，該機(jī)制一直未得到闡明。
　　 近來(lái)，高遷移率族蛋白1(HMGB1)作為信號(hào)分子介導(dǎo)炎癥和組織損傷的作用備受關(guān)注。HMGB1作為細(xì)胞核內(nèi)的非組蛋白作用于DNA的復(fù)制、重組、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)，同時(shí)，它又可以被細(xì)胞分泌到細(xì)胞外參與到炎癥反應(yīng)、免疫、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移、腫瘤發(fā)展和組織再生等。HM

3、GB1作為炎性因子可以刺激骨組織的吸收。也有體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)刺激骨細(xì)胞凋亡可以檢測(cè)到培養(yǎng)上清中HMGB1含量的增高。因此可以假設(shè)骨細(xì)胞感受到外界刺激并釋放HMGB1，同時(shí)HMGB1反過(guò)來(lái)會(huì)刺激破骨細(xì)胞進(jìn)行骨吸收活動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)采用脂多糖誘導(dǎo)小鼠骨細(xì)胞系MLO-Y4和小鼠成骨細(xì)胞系MC-3T3-E1的凋亡，觀(guān)察兩種細(xì)胞HMGB1的分泌情況。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 細(xì)胞培養(yǎng):復(fù)蘇培養(yǎng)小鼠骨細(xì)胞系和成骨細(xì)胞系細(xì)胞，細(xì)胞增殖到足夠?qū)嶒?yàn)

4、使用數(shù)量后種六孔板，每孔4×105個(gè)細(xì)胞。種板后細(xì)胞采用不含血清的α-MEM培養(yǎng)，并加入脂多糖(LPS)刺激細(xì)胞凋亡，LPS的終濃度設(shè)為五個(gè)組別分別為0ug/ml、0.5ug/ml、1ug/ml、5ug/ml和10ug/ml。標(biāo)本收集檢測(cè):按細(xì)胞接種后第6小時(shí)、18小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)分別收取五個(gè)LPS濃度組別的細(xì)胞，固定后進(jìn)行DAPI染色，觀(guān)察細(xì)胞核的變化，以此判斷細(xì)胞的凋亡狀況;另外收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清進(jìn)行HMGB1基因

5、表達(dá)的檢測(cè)和上清中分泌蛋白量的檢測(cè)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 DAPI染色可以發(fā)現(xiàn)，MLO-Y4對(duì)LPS刺激的反應(yīng)比較敏感而持久，MLO-Y4細(xì)胞的凋亡率呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性增加，48小時(shí)和72小時(shí)時(shí)細(xì)胞的凋亡率基本過(guò)半;MC-3T3細(xì)胞在18小時(shí)到24小時(shí)出現(xiàn)了一個(gè)凋亡高峰。ELISA檢測(cè)上清中的HMGB1含量發(fā)現(xiàn)小鼠骨細(xì)胞系MLO-Y4在18小時(shí)開(kāi)始就有了顯著意義的增加，48小時(shí)分泌量達(dá)到頂峰，之后持平并有下降趨勢(shì)。小鼠成

6、骨細(xì)胞系MC-3T3-E1在18到24小時(shí)達(dá)到高峰狀態(tài)，之后HMGB1的含量逐漸下降，與凋亡率的變化呈現(xiàn)一致性。實(shí)時(shí)定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在MLO-Y4中相對(duì)于對(duì)照組HMGB1mRNA的表達(dá)量增加也呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性，而MC-3T3組別僅在18小時(shí)到24小時(shí)的5μg/ml和10μg/mlLPS刺激組別出現(xiàn)了HMGB1mRNA表達(dá)量的增高。
　　 結(jié)論：
　　 細(xì)菌性脂多糖可以誘導(dǎo)小鼠骨細(xì)胞系MLO-Y4凋亡及釋放HMGB1，且后者呈現(xiàn)