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文檔簡介
1、目的:
矽肺是生產(chǎn)過程中長期吸入游離SiO2粉塵引起的,以肺部廣泛的結(jié)節(jié)性纖維化為主的全身性疾病。矽肺是塵肺中最常見,危害最為嚴重的一種,其發(fā)生過程十分復(fù)雜。近年來我國矽肺發(fā)病形勢仍然十分嚴峻,在現(xiàn)有的矽肺研究的基礎(chǔ)上,進一步研究探討矽肺的發(fā)病機制依然具有很大的意義。
自噬(autophagy)是自噬體與溶酶體相結(jié)合降解細胞內(nèi)大分子和損傷細胞器的過程,自噬的主要功能是維持細胞內(nèi)細胞器降解代謝的平衡?;A(chǔ)自噬活動對維持
2、細胞內(nèi)環(huán)境的動態(tài)平衡起著重要的作用。巨噬細胞的自噬活動十分明顯,一直被研究者所熱衷。肺泡巨噬細胞(alveolar macrophage,AM)是SiO2作用的主要靶細胞,研究表明,肺泡巨噬細胞的凋亡以及其釋放的促纖維化因子在肺纖維化的發(fā)生過程中扮演著重要的角色。自噬作為新的細胞程序性死亡方式,在肝纖維化、腎纖維化和心肌纖維化的過程中都發(fā)揮了重要的作用。同樣,我們在前期的動物實驗中發(fā)現(xiàn)自噬在矽肺纖維化的進展中發(fā)生了變化,提示自噬可能也是
3、矽肺發(fā)生發(fā)展不可或缺的環(huán)節(jié)之一。但矽塵誘導(dǎo)AMs自噬的機制和自噬在AMs中的作用目前尚不清楚。
煤礦生產(chǎn)環(huán)境中存在著各種類型的革蘭氏陰性菌,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分,而且LPS能夠誘導(dǎo)多種細胞如巨噬細胞自噬的發(fā)生,AMs在清除肺泡和肺間質(zhì)的粉塵和細菌方面發(fā)揮著重要的防御作用。研究表明,矽塵能夠降低肺泡巨噬細胞的殺菌能力。LPS是否能誘導(dǎo)矽肺AMs自噬的發(fā)生,以及LPS
4、是否能夠通過誘導(dǎo)自噬的發(fā)生影響矽肺的發(fā)病進程,目前尚不清楚。本研究以矽肺患者為研究對象,收集其大容量肺灌洗液中的AMs,研究LPS對AMs自噬的作用及其機制,并探討AMs的自噬對矽肺發(fā)展的影響,以期在自噬層面為矽肺提供新的發(fā)病機制,并且為控制矽肺發(fā)病進展提供科學(xué)依據(jù)。
方法:
一、研究對象的選擇
本研究選取了中國煤礦工人北戴河療養(yǎng)院53例男性接觸矽塵并且接受大容量肺灌洗患者,通過患者的接塵性質(zhì)以及X線片上的
5、結(jié)節(jié)病理改變來確定所研究的患者都是以矽肺病變?yōu)橹鳌Q芯窟x取了11例觀察對象(Observer),即患者在作業(yè)環(huán)境中接觸了粉塵,但是X線片并不能發(fā)現(xiàn)肺部有矽肺病變的改變,42例矽肺不同期別(Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期)的患者。通過調(diào)查表了解研究對象的基本情況,包括年齡、民族、工齡、接塵年齡等。矽肺病診斷由當(dāng)?shù)貕m肺病診斷小組根據(jù)我國《塵肺病診斷標(biāo)準》(GBZ70-2009)進行診斷。所有研究對象均排除與肺部相關(guān)的疾?。ㄈ绶伟顒有苑谓Y(jié)核等)及有塵肺
6、并發(fā)癥、嚴重心、肝、腎疾患以致不能進行肺灌洗者。所有納入研究者肺灌洗前簽署知情同意書。
二、研究內(nèi)容和方法
?。ㄒ唬?、基本信息調(diào)查
根據(jù)課題研究目的設(shè)計合理的調(diào)查表,調(diào)查工作由本人直接負責(zé),調(diào)查采用面對面問卷式,調(diào)查研究對象的一般情況、職業(yè)史、接塵史、疾病史等。職業(yè)史資料來自肺灌洗者所在單位的勞資部門或職業(yè)病管理部門,塵肺診斷、肺灌洗情況以及肺部并發(fā)癥的資料來自北戴河療養(yǎng)院??漆t(yī)院的住院病案。
(二
7、)、巨噬細胞的分離、純化和培養(yǎng)
所有研究對象全麻下實施大容量肺灌洗,收集肺灌洗回收液,留取第一次肺灌洗液1ml。余下收集的肺灌洗液雙層無菌紗布過濾除去粘液后,離心,用PBS洗滌三次,每次1500 rpm離心10 min,細胞計數(shù)。取5×106 AMs加入盛有DMEM培養(yǎng)基的六孔培養(yǎng)板或細胞培養(yǎng)皿中,37℃貼壁培養(yǎng)2h,更換培養(yǎng)基后,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,留取上清,收獲細胞。AM培養(yǎng)24 h后,分別采用普通光學(xué)顯微鏡(瑞氏-吉姆薩染
8、色)、激光共聚焦顯微鏡(PI及抗人-CD68-FITC染色)觀察AMs形態(tài)特征和純化效果。
?。ㄈ?、AMs自噬及其相關(guān)蛋白的檢測
AMs培養(yǎng)24 h后,分別采用Western Blotting法和免疫熒光法測定和觀察LC3的表達情況,采用透射電子顯微鏡觀察自噬體和溶酶體的形態(tài)和數(shù)量。采用Western Blotting測定SQSTM1/p62,LAMP2,調(diào)控自噬的相關(guān)信號蛋白BECN1/Beclin1,p-mTOR
9、,Toll樣受體4(TLR4)及其相關(guān)信號蛋白MyD88,TICAM1的表達。ECL熒光顯色,X光片曝光、定影,Image J圖像分析軟件做灰度分析,檢測條帶的平均光強度,計算其相對表達量。
?。ㄋ模?、LPS對AMs自噬的調(diào)控分析
采用抗人的ELISA試劑盒測定肺灌洗液中LPS的表達水平。分別將6例觀察對象、Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期矽肺的AMs純化后,按照給予的處理分為3組:未處理組,LPS組,HTA125組。采用Wester
10、n Blotting檢測TLR4、MyD88、TICAM1、Beclin1、p-mTOR、SQSTM1/p62,LAMP2的表達。
?。ㄎ澹⒆允蓪PS誘導(dǎo)AMs凋亡及炎性細胞因子表達的影響分析
分別將6例觀察對象、Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期矽肺的AMs純化后,按照給予的處理分為3組:未處理組,LPS組,LPS+3MA組。采用TUNEL法檢測各組AM的凋亡情況,采用抗人的ELISA試劑盒測定各組AM培養(yǎng)上清中炎性細胞因子IL-
11、1β、IL-8、TNF-α的表達水平,采用Western Blotting檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3、NF-kB的表達。
?。?、統(tǒng)計分析
資料整理后,用Excel建立數(shù)據(jù)庫,全部數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計分析,結(jié)果表示為mean±SD。采用單因素方差分析(ANOVA)比較各組間的統(tǒng)計學(xué)差異,當(dāng)差異有統(tǒng)計學(xué)意義時,用LSD進行組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果:
12、> 一、矽肺患者AMs自噬活性增強
共聚焦顯微鏡下觀察,Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組的AMs胞漿中比觀察對象組包含更多的LC3陽性亮斑,western檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達水平也高于觀察對象組(P<0.05),而且Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組較之Ⅰ期矽肺組AMs胞漿中LC3陽性亮斑增多,western檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達水平也同樣高于Ⅰ期矽肺組(P<0.05)。
二、矽肺患者AMs中自噬體數(shù)量增多,溶酶體數(shù)量減
13、少
透射電子顯微鏡下觀察AMs中的自噬體數(shù)隨著矽肺期別的增加而增多,Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組自噬體數(shù)高于觀察對象組,Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組高于Ⅰ期矽肺組,而溶酶體數(shù)隨著矽肺期別的增加而減少(P<0.05)。
三、矽肺患者AMs自噬降解出現(xiàn)障礙
溶酶體相關(guān)膜蛋白LAMP2表達隨著矽肺期別的增加而減少(P<0.05)。自噬降解的底物蛋白SQSTM1在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組的表達高于觀察對象組,Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組SOSTM
14、1表達高于Ⅰ期組(P<0.05),
四、矽肺患者AMs自噬的變化與mTOR非依賴和mTOR依賴調(diào)節(jié)機制有關(guān)
自噬相關(guān)信號通路蛋白BECN1/Beclin1在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組的表達高于觀察對象組,Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組BECN1蛋白表達高于Ⅰ期組(P<0.05),而自噬相關(guān)信號通路蛋白p-mTOR的表達與之相反,p-mTOR在觀察對象組中的表達高于Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組,Ⅰ期矽肺組p-mTOR表達高于Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組(
15、P<0.05)。
五、矽肺患者AMs中TLR4蛋白表達降低
?、衿?、Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組AMs中的TLR4表達低于觀察對象組,Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組TLR4的表達低于Ⅰ期矽肺組(P<0.05)。TLR4相關(guān)信號通路蛋白MYD88和TICAM1在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組的表達低于觀察對象組,Ⅱ期、Ⅲ期矽肺組MYD88和TICAM1的表達低于Ⅰ期矽肺組(P<0.05)。
結(jié)論:
1、矽肺患者AMs中溶酶體數(shù)量的減少
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