外周血單核細(xì)胞免疫耐受在脂多糖誘導(dǎo)的大鼠腦內(nèi)炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)是許多神經(jīng)系統(tǒng)變性病共同存在的發(fā)病機(jī)制，而帕金森病(PD)作為發(fā)病率第二的嚴(yán)重危害中老年人健康的神經(jīng)系統(tǒng)變性病，包括腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活、前炎性因子的過度釋放及細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)系統(tǒng)過度激活的腦內(nèi)炎癥是PD的重要病因。其中小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫活動的核心，其活化后具備抗原提呈、吞噬、釋放超氧離子及前炎性因子等能力，能對周圍的神經(jīng)元造成損傷，因而對小膠質(zhì)細(xì)胞激活及腦內(nèi)炎癥的有效調(diào)控成為影響PD的關(guān)鍵。

2、　　盡管受到血腦屏障的保護(hù)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)一直受到外周免疫的深刻影響。一次大劑量LPS腹腔注射誘發(fā)的外周炎癥足以引起健康中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫激活和多巴胺神經(jīng)元的變性死亡。外周血單核細(xì)胞(PBM)是外周免疫的啟動者，處于啟動調(diào)控外周免疫的核心地位，同時外周血單核細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞同屬單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，具有相似的起源、功能及受體表達(dá)，且PBM具有變形穿越能力，它能穿越血腦屏障入腦演變成小膠質(zhì)細(xì)胞或血管周巨噬細(xì)胞等腦內(nèi)特殊巨噬細(xì)胞群直接或間接參與中

3、樞炎癥反應(yīng)，因此不難推測PBM在外周與中樞的聯(lián)系中扮演了重要角色，是外周影響中樞免疫活動的重要通路。
　　免疫耐受是機(jī)體面對持續(xù)抗原威脅或連續(xù)打擊的一種保護(hù)機(jī)制，它避免了不必要損傷的發(fā)生，是機(jī)體防御機(jī)制的重要組成部分，而單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)在免疫耐受的整個過程中發(fā)揮了主要的作用。PD患者外周血中持續(xù)存在能夠誘導(dǎo)PBM發(fā)生免疫耐受低劑量的LPS，而實際上PD患者外周血免疫細(xì)胞處于激活狀態(tài)，提示PD患者可能存在PBM免疫耐受的障礙，而PB

4、M的免疫耐受障礙的存在可能是PD患者腦內(nèi)炎癥失控的一個重要發(fā)病機(jī)制。CD200R是PBM表面常規(guī)表達(dá)的受體，積極參與了巨噬細(xì)胞的免疫下調(diào)，同時CD200/CD200R通路與免疫耐受密切相關(guān)。我們既往的研究結(jié)果顯示PD患者外周血單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞在應(yīng)激環(huán)境中CD200/CD200R通路難以有效發(fā)揮作用。因此我們推測CD200/CD200R通路積極參與了PBM的免疫下調(diào)，CD200/CD200R通路異常可能是PD患者外周PBM免疫耐受失

5、敗的重要機(jī)制。
　　考慮到低劑量LPS能夠誘導(dǎo)PBM發(fā)生免疫耐受，而PBM是外周免疫與中樞連接的重要中介，我們推測低劑量LPS誘導(dǎo)了PBM的免疫耐受，使其免疫活動下調(diào)，后者影響并限制了腦內(nèi)炎癥的發(fā)展，使更多神經(jīng)元免于無辜的炎癥損傷，從而對損傷神經(jīng)元起到保護(hù)作用。而該過程中PBM免疫耐受的形成是抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化、下調(diào)腦內(nèi)炎癥、保護(hù)神經(jīng)元存活的關(guān)鍵。因此PBM的免疫耐受有可能是中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身保護(hù)、避免過度炎癥損傷的重要外周機(jī)制。<

6、br>　　方法:1、為了獲得能夠誘導(dǎo)大鼠PBM免疫耐受的合適的LPS劑量，我們采用NS、LPS0.1mg/kg、LPS0.3mg/kg、LPS0.9mg/kg劑量梯度連續(xù)4天間隔24小時腹腔注射，于第5天我們采用貼壁法得到大鼠外周血PBM并再次給予LPS100ng/ml刺激，通過刺激后細(xì)胞上清前炎性因子TNF-α、IL-1β含量及PBM表面抗原TLR4的變化情況來確定大鼠免疫狀態(tài)以得到能夠誘導(dǎo)PBM免疫耐受的合適的LPS劑量。2、我們采

7、用大劑量LPS（5mg/kg）腹腔注射來誘導(dǎo)大鼠腦內(nèi)炎癥模型。同時為了驗證PBM在外周LPS誘導(dǎo)腦內(nèi)炎癥的作用，我們采用氯膦酸二鈉脂質(zhì)體鼠尾靜脈注射來耗竭大鼠的PBM，即PBM耗竭組。實驗分為4組:正常對照組(n=15)、LPS組(n=15)、PBM免疫耐受+LPS組(n=15)、PBM耗竭+LPS組(n=15);分別對各組大鼠大劑量LPS腹腔注射后48h內(nèi)的生存率進(jìn)行鑒定。3、為了對PBM及PBM的免疫狀態(tài)對腦內(nèi)炎癥的影響進(jìn)行研究，分

8、別對LPS組(n=6)、PBM免疫耐受+LPS組(n=6)、PBM耗竭+LPS組（n=6）各組予大劑量LPS注射后的2h、1d、7d對外周及中樞的免疫狀態(tài)進(jìn)行鑒定，包括外周血上清前炎性因子TNF-α、IL-1β含量及PBM表面抗原TLR4、CD200R的變化，腦內(nèi)黑質(zhì)前炎性因子TNF-α、IL-1β的含量及小膠質(zhì)細(xì)胞的激活標(biāo)記物CD68、MHCⅡ的表達(dá)情況及各組黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的存活情況。4、為了對CD200/CD200R通路在PBM

9、免疫耐受形成中的作用進(jìn)行研究，我們在體外采用以終濃度為10ng/ml的LPS的10％培養(yǎng)基孵育24h誘導(dǎo)PBM的免疫耐受并采用終濃度為5ug/ml的抗CD200R1抗體阻斷CD200/CD200R通路。我們將貼壁法提取的正常大鼠的PBM分為對照組、PBM免疫耐受組(10ng/ml LPS)及PBM免疫耐受+anti-CD200R1組（10ng/ml LPS+5ug/ml anti-CD200R1抗體），分別孵育24小時后給予LPS100

10、ng/ml再刺激4h后檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α及IL-1β含量，從而在體外研究該通路在PBM免疫耐受形成中的作用。
　　結(jié)果:1、低劑量LPS腹腔注射可誘導(dǎo)PBM的免疫耐受。大鼠0.3mg/kg LPS組連續(xù)4天腹腔注射后提取的外周血PBM再次受到LPS刺激時表現(xiàn)為前炎性因子TNF-α(P＜0.01)、IL-1β（P＜0.01）的含量較對照組明顯下降，PBM表面TLR4的表達(dá)也明顯下降(P＜0.01);而0.1mg/kg組

11、及0.9mg/kg組前炎性因子TNF-α、IL-1β含量及TLR4的表達(dá)較對照組無顯著差異。2、大劑量LPS腹腔注射后48h內(nèi)大鼠生存率示:LPS組的大鼠生存率為66.67％，而正常對照組、PBM免疫耐受+LPS組、PBM耗竭+LPS組大鼠生存率為100％，PBM免疫耐受及PBM耗竭均顯著提高了大劑量LPS腹腔注射后大鼠生存率(P＜0.01)，并缺少腹瀉、眼角出血等全身炎癥表現(xiàn)。3、PBM免疫耐受及免疫耗竭抑制大劑量LPS腹腔注射誘導(dǎo)的

12、外周炎癥反應(yīng)。表現(xiàn)為PBM免疫耐受+LPS組、PBM耗竭+LPS組在大劑量LPS腹腔注射后2h、1d、7d時血清前炎性因子TNF-α、IL-1β的含量均顯著低于LPS組，PBM免疫耐受+LPS組的TLR4的表達(dá)在1d時也顯著低于LPS組(P＜0.05)，7d時TLR4表達(dá)量差異無顯著性(P＞0.05)。4、PBM免疫耐受及免疫耗竭抑制大劑量LPS腹腔注射誘發(fā)的腦內(nèi)炎癥反應(yīng)。表現(xiàn)為大劑量LPS腹腔注射后2h、1d、7d時PBM免疫耐受+L

13、PS組、PBM耗竭+LPS組腦內(nèi)黑質(zhì)前炎性因子TNF-α、IL-1β含量及小膠質(zhì)細(xì)胞的激活標(biāo)記物CD68、MHCⅡ的表達(dá)均顯著低于LPS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。5、大劑量LPS腹腔注射后7d時正常對照組、LPS組、PBM免疫耐受+LPS組及PBM耗竭+LPS組各組黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量差異無顯著性(P＞0.05)，各組均未觀察到多巴胺能神經(jīng)元的死亡。6、PBM免疫耐受通過上調(diào)細(xì)胞表面的CD200R的表達(dá)量來抑制過度炎癥反應(yīng)

14、，PBM免疫耐受+LPS組在大劑量LPS腹腔注射后1d時PBM表面CD200R表達(dá)量顯著高于LPS組(P＜0.05)，7d時CD200R的表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)。7、CD200/CD200R通路為誘導(dǎo)PBM免疫耐受所必需，體外阻斷CD200/CD200R1通路后PBM再次受到LPS刺激后細(xì)胞上清前炎性因子TNF-α、IL-1β的含量明顯高于PBM免疫耐受組(P＜0.05)，而與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。
　　結(jié)