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文檔簡(jiǎn)介
1、動(dòng)脈粥樣硬化性心腦血管疾病目前是威脅人類健康的頭號(hào)殺手。深入研究動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的基礎(chǔ)分子機(jī)制,尋找有效的抗動(dòng)脈粥樣硬化靶點(diǎn),一直是生命科學(xué)研究中最活躍的前沿領(lǐng)域之一。目前認(rèn)為,AS是動(dòng)脈壁對(duì)各種損傷過度表達(dá)的慢性炎癥過程。在此過程中,氧化應(yīng)激(oxidative stress,OS)是細(xì)胞損傷的主要原因,活性氧(ROS)是動(dòng)脈粥樣硬化血管炎癥的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素,ROS激活并促進(jìn)氧化應(yīng)激瀑布鏈,形成惡性循環(huán),加劇AS進(jìn)程并誘發(fā)斑塊不穩(wěn)定
2、和破裂而發(fā)生嚴(yán)重臨床心血管事件。因此,阻斷氧化應(yīng)激和炎癥過程,已成為當(dāng)前抗動(dòng)脈粥樣硬化研究的重要靶標(biāo)。
cyclophilinA(CyPA)為親環(huán)素家族成員之一,最近研究發(fā)現(xiàn)其在AS斑塊中高表達(dá),是體內(nèi)對(duì)AS氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的主要活性氧誘導(dǎo)因子之一,在氧化應(yīng)激條件下,CyPA的表達(dá)和分泌增加,并可由細(xì)胞內(nèi)分泌至細(xì)胞外,細(xì)胞分泌CyPA對(duì)心血管疾病的病理、生理起重要的調(diào)節(jié)作用,特別是AS發(fā)生、血管增殖及狹窄等。細(xì)胞外CyP
3、A增強(qiáng)AS進(jìn)程中的主要炎癥細(xì)胞-單核/巨噬細(xì)胞的炎癥活動(dòng),但是CypA以何種方式與單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞相互作用,其中的作用機(jī)制以及相關(guān)調(diào)控還不清楚。
在本課題中,我們以體外培養(yǎng)的人類單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞為研究對(duì)象,以體外人的重組cyclophilinA蛋白模擬氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)產(chǎn)物作為刺激,擬從CypA誘導(dǎo)的單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)細(xì)胞模型中,探討細(xì)胞外CypA對(duì)單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用結(jié)果、深層次的作用機(jī)制以及相關(guān)調(diào)控,擬為設(shè)計(jì)
4、和開發(fā)新的抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物靶點(diǎn)提供初步的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
第一部分 cyclophilinA在單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用
目的:探討cyclophilinA在單核細(xì)胞氧化應(yīng)激炎癥反應(yīng)中的相關(guān)作用。
方法:人類單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞常規(guī)體外培養(yǎng),以CypA作為氧化應(yīng)激炎癥反應(yīng)的主要活性氧誘導(dǎo)因子刺激,通過細(xì)胞遷移趨化實(shí)驗(yàn)(Transwell)檢測(cè)CypA對(duì)單核細(xì)胞遷移趨化的影響;炎癥刺激后,酶聯(lián)
5、免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)單核細(xì)胞培養(yǎng)液中主要炎癥反應(yīng)因子白介素6(IL-6),腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量變化;明膠酶譜法測(cè)定基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的活性變化
結(jié)果:(1)CypA作為炎癥刺激,可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞的遷移趨化;(2)CypA(200ng/ml)誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌炎癥反應(yīng)因子白介素6(IL-6);(3)CypA(200ng/ml)增強(qiáng)單核細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的活性;(4)Cyp
6、A對(duì)單核細(xì)胞腫瘤壞死因子α(TNF-α)的分泌沒有影響。
結(jié)論:(1)CypA對(duì)單核細(xì)胞具有遷移趨化的作用;(2)CypA可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌炎癥反應(yīng)因子白介素6(IL-6),但是對(duì)腫瘤壞死因子α(TNF-α)的分泌沒有影響;(3)CypA可以增強(qiáng)單核細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的活性。
第二部分 cyclophilinA對(duì)單核細(xì)胞的促炎癥反應(yīng)與炎癥信號(hào)通路的關(guān)系
目的:探討cycloph
7、ilinA對(duì)單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的幾種重要炎癥信號(hào)通路的影響;cyclophilinA是否通過某些重要炎癥信號(hào)通路調(diào)控炎癥反應(yīng)因子的分泌。
方法:人類單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞常規(guī)體外培養(yǎng),以CypA作為氧化應(yīng)激炎癥反應(yīng)因子刺激,使用Western blotting方法檢測(cè)了NF-κB炎癥信號(hào)通路、MAPK炎癥信號(hào)通路(包括ERK,JNK,p-38信號(hào)通路)的表達(dá)和EMMPRIN蛋白的表達(dá);使用ERK1/2通路抑制劑PD980
8、59預(yù)處理細(xì)胞后,Western blotting方法檢測(cè)了NF-κB炎癥信號(hào)通路表達(dá)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)單核細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥反應(yīng)因子白介素6(IL-6)含量、明膠酶譜法測(cè)定基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的活性變化。
結(jié)果:(1)CypA能夠激活單核細(xì)胞NF-κB炎癥信號(hào)通路;(2)CypA能夠激活單核細(xì)胞MAPK(包括ERK,JNK,p-38信號(hào)通路)炎癥信號(hào)通路;(3)ERK1/2通路抑制劑PD980
9、59預(yù)處理細(xì)胞后,NF-κB炎癥信號(hào)通路的激活被抑制;(4)ERK1/2通路抑制劑PD98059預(yù)處理細(xì)胞后,基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的活性被抑制;(5)ERK1/2通路抑制劑PD98059預(yù)處理細(xì)胞后,白介素6(IL-6)分泌沒有變化;(6)CypA對(duì)單核細(xì)胞EMMPRIN的表達(dá)沒有影響。
結(jié)論:(1)CypA能夠激活單核細(xì)胞NF-κB炎癥信號(hào)通路;(2)CypA能夠激活單核細(xì)胞MAPK(包括ERK,JNK,p-3
10、8信號(hào)通路)炎癥信號(hào)通路;(3)CypA通過MAPK炎癥信號(hào)通路來激活NF-κB炎癥信號(hào)通路;(4)CypA通過MAPK-NF-κB炎癥信號(hào)通路增強(qiáng)MMP-9的活性。
第三部分調(diào)控EMMPRIN對(duì)cyclophilinA在單核細(xì)胞促炎癥反應(yīng)中的影響
目的:探討EMMPRIN在cyclophilinA促單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用,調(diào)控EMMPRIN對(duì)cyclophilinA誘導(dǎo)的單核細(xì)胞遷移趨化、炎癥信號(hào)通路激活
11、和炎性細(xì)胞因子釋放的影響。
方法:人類單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞常規(guī)體外培養(yǎng)。使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,RNA干擾技術(shù)沉默EMMPRIN基因表達(dá)和/或使用EMMPRIN活性阻滯抗體阻斷EMMPRIN活性的方法干預(yù)處理細(xì)胞后,以CypA作為氧化應(yīng)激炎癥反應(yīng)因子刺激,細(xì)胞遷移趨化實(shí)驗(yàn)(Transwell)檢測(cè)單核細(xì)胞的遷移趨化;使用Western blotting方法檢測(cè)NF-κB炎癥信號(hào)通路和MAPK炎癥信號(hào)通路(包括ERK,JNK,p
12、-38信號(hào)通路)的表達(dá);酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)白介素6(IL-6)表達(dá);明膠酶譜法測(cè)定基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的活性。
結(jié)果:(1)調(diào)控EMMPRIN能夠抑制CypA對(duì)單核細(xì)胞的遷移趨化作用;(2)調(diào)控EMMPRIN能夠抑制CypA對(duì)單核細(xì)胞NF-κB炎癥信號(hào)通路和MAPK(包括ERK,JNK,p-38信號(hào)通路)炎癥信號(hào)通路的激活;(3)調(diào)控EMMPRIN能夠抑制CypA誘導(dǎo)的單核細(xì)胞MMP-9的活性增
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