黃連素影響動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：⑴觀察黃連素對巨噬細(xì)胞MMP-9、EMMPRIN基因和蛋白表達(dá)的影響。⑵明確MAPKs通路是否參與EMMPRIN表達(dá)，觀察不同濃度黃連素對相應(yīng)的MAPKs通路的影響。⑶觀察不同濃度黃連素對oxLDL刺激的巨噬細(xì)胞NF-kB(p65核轉(zhuǎn)位、IKB-α磷酸化降解等)通路的影響。⑷oxLDL在動脈粥樣硬化發(fā)展過程中的致病作用已得到證實(shí)。泡沫細(xì)胞形成是動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)重要的特征。本研究的目的是觀察黃連素對巨噬細(xì)胞源泡沫細(xì)胞形成的影響并探

2、討可能涉及的分子機(jī)制。⑸觀察黃連素對oxLDL刺激后血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌粘附分子的影響及對單核細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞粘附能力的改變。 方法：①以佛波醇(PMA)誘導(dǎo)的單核源巨噬細(xì)胞和oxLDL刺激的巨噬細(xì)胞為細(xì)胞模型，i、觀察黃連素對單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞過程中MMP-9、EMMPRIN基因和蛋白表達(dá)以及MM-9分泌活性的影響ii、觀察黃連素對oxLDL刺激后的巨噬細(xì)胞MMP-9、EMMPRIN基因和蛋白表達(dá)的影響。以Real-time P

3、CR分析檢測MMP-9、EMMPRIN的mRNA表達(dá)水平；Western blot、流式細(xì)胞儀檢測MMP-9、EMMPRIN蛋白表達(dá)；明膠酶譜法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中MMP-9的活性。②人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞予PMA刺激不同時(shí)間(0-60min)，細(xì)胞總蛋白用于Western blot分析檢測細(xì)胞MAPKs(ERK1/2、p38或JNK)磷酸化程度，然后用相應(yīng)的MAPKs通路特異抑制劑處理PMA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞，RT-PCR檢測細(xì)胞EM

4、MPRIN mRNA水平，Western blot檢測細(xì)胞EMMPRIN表達(dá)；并觀察不同濃度黃連素對MAPKs(ERK1/2、p38或JNK)磷酸化程度的影響。③采用PMA誘導(dǎo)分化的單核源巨噬細(xì)胞作為吞噬脂質(zhì)---oxLDL(Dil-oxLDL)的細(xì)胞模型。細(xì)胞分為空白對照組，oxLDL組和oxLDL+黃連素組。用油紅染色、流式細(xì)胞儀檢測Dil標(biāo)記的oxLDL，觀察黃連素對巨噬細(xì)胞吞噬oxLDL能力的影響。用高效液相色譜(HPLC)分析

5、各組細(xì)胞內(nèi)總膽固醇和膽固醇酯的含量，明確黃連素對泡沫細(xì)胞形成的影響。流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞表面清道夫受體CD36、CD68和LOX-1等表達(dá)，部分揭示黃連素影響泡沫細(xì)胞形成可能的分子機(jī)制。④表達(dá)GFP的腺病毒(GFP-Ad)感染人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞，然后感染腺病毒的THP-1細(xì)胞與oxLDL刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)共培養(yǎng)。細(xì)胞分為空白對照組、oxLDL組和oxLDL+黃連素組。用倒置熒光顯微鏡拍攝各組細(xì)胞GFP熒光照片

6、，流式細(xì)胞儀檢測各組表達(dá)GFP的細(xì)胞百分率。 結(jié)果：⑴與空白對照組相比，單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞后，MMP-9、EMMPRIN基因和蛋白表達(dá)明顯增加；黃連素能抑制其MMP-9、EMMPRIN基因和蛋白的表達(dá)上調(diào)，且MMP-9的酶解活性明顯受抑制，呈濃度依賴性，但MMP-2的酶解活性不受影響。OxLDL刺激巨噬細(xì)胞，可顯著上調(diào)MMP-9、EMMPRIN表達(dá)。⑵THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA處理后，MAPKs信號通路——ERK1/2、p38、

7、JNK1/2磷酸化程度增加，提示ERK1/2、p38、JNK1/2信號傳導(dǎo)通路均被激活；ERK1/2通路特異抑制劑PD98059以及p38通路特異抑制劑SB203580均可抑制巨噬細(xì)胞EMMPRIN mRNA和蛋白表達(dá)。⑶oxLDL組巨噬細(xì)胞吞噬oxLDL能力明顯高于空白對照組，細(xì)胞內(nèi)的膽固醇酯(CE)/總膽固醇(TC)值明顯增加(68.03±1.76％vs。34.46±1.29％)。不同濃度黃連素處理組可見巨噬細(xì)胞吞噬oxLDL能力較

8、oxLDL組顯著減弱，且細(xì)胞內(nèi)TC和CE的含量也較oxLDL組減少，CE/TC值呈濃度依賴性降低。⑷與空白對照組相比，oxLDL組表達(dá)GFP的細(xì)胞數(shù)顯著增高(13％ vs47％，p<0.001)，提示表達(dá)GFP的人單核細(xì)胞THP-1向HUVEC粘附明顯增多。黃連素處理組，表達(dá)GFP的細(xì)胞比例較oxLDL組有明顯減少趨勢，呈濃度依賴性(47％ vs38％，33％，32％ and26％，p<0.001)，說明黃連素能使單核細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞粘附

9、減少。 結(jié)論：①單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化過程中，黃連素抑制MMP-9和EMMPRINmRNA和蛋白的表達(dá)，并減弱MMP-9的酶活性，但不影響MMP-2的酶活性。②在oxLDL刺激的巨噬細(xì)胞，MMP-9和EMMPRIN mRNA和蛋白表達(dá)均上調(diào)，黃連素處理可減少M(fèi)MP-9和EMMPRIN表達(dá)，呈濃度和時(shí)間依賴性。③在單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化過程，p38和ERK1/2通路激活參與巨噬細(xì)胞EMMPRIN表達(dá)上調(diào)。④黃連素對巨噬細(xì)胞EMMP

10、RIN、MMP-9表達(dá)的抑制效應(yīng)，(至少部分)，是通過降低p38和ERK1/2磷酸化來實(shí)現(xiàn)的。⑤黃連素抑制oxLDL刺激的巨噬細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB通路的激活。第三部分黃連素對巨噬細(xì)胞吞噬oxLDL能力及泡沫細(xì)胞形成的影響。⑥黃連素抑制單核源巨噬細(xì)胞吞噬oxLDL，減少泡沫細(xì)胞的形成。⑦黃連素抑制巨噬細(xì)胞表面清道夫受體CD36、LOX-1表達(dá)。⑧黃連素通過抑制HUVEC分泌粘附分子VCAM-1及ICAM-1，減少單核細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞