視黃醇對脂多糖誘導的大鼠乳腺炎癥反應的調節(jié)及機制研究.pdf

1、本實驗選用健康SD大鼠,利用LPS誘發(fā)試驗性大鼠乳腺炎模型,研究多功能營養(yǎng)素視黃醇對大鼠乳腺防御機能的影響和保護作用；并建立原代培養(yǎng)的大鼠乳腺上皮細胞炎癥反應模型,進一步在體外研究了視黃醇對大鼠乳腺上皮細胞炎癥反應的調節(jié)機制。
　　 1.視黃醇對試驗性乳腺炎大鼠的保護作用研究
　　 為研究視黃醇對LPS誘發(fā)的試驗性乳腺炎大鼠的保護作用,40只清潔級SD孕鼠隨機分為正常對照組(NC,n=8)、陽性對照組(PC,n=8)和試

2、驗組(T,n=24)。自懷孕第十天起,試驗組分別灌胃視黃醇(溶解于大豆油)4000 I.U/kg·d(L,n=8)、8000 I.U/kg·d(M,n=8)、16000 I.U/kg·d(H,n=8),對照組灌胃等量的大豆油,連續(xù)灌胃十天。產后72 h分別灌注滅菌生理鹽水和10μg/側LPS到大鼠第四對乳腺(兩側)內,12 h處死大鼠,收集血清及乳腺組織樣品。LPS灌注乳腺12 h后,乳腺組織中髓過氧化物酶(myeloperoxidas

3、e,MPO)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAGase)活性,腫瘤壞死因子-α(tumor necrosisfactor-α,TNF-α)、白細胞介素-8(interleukin-8,IL-8)均顯著升高,血清中MPO、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、總抗氧化能力(total anti-oxidizingcapability,T-AO

4、C)及乳腺組織中白細胞介素-2(interleukin-2,IL-2)水平顯著降低。與陽性對照組相比,灌胃視黃醇顯著降低乳腺組織中MPO、NAGase的活性及TNF-α水平,顯著提高血清中IL-2水平；低、中劑量視黃醇能降低中性粒細胞(neutrophil,PMN)在乳腺組織中的浸潤,提高血清SOD活性及T-AOC,改善因LPS引起的外周血T淋巴細胞CD4+與CD8+比值的失衡.結果證實視黃醇對LPS誘發(fā)的試驗性乳腺炎大鼠有一定的保護作

5、用。
　　 2.視黃醇對試驗性乳腺炎大鼠炎性細胞因子釋放的影響
　　 為探討視黃醇對試驗性乳腺炎大鼠炎性細胞因子釋放的調節(jié)作用機制,72只清潔級SD懷孕大鼠被隨機分成對照組(C,n=36)和試驗組(T,n=36)。懷孕第十天起,每天灌胃視黃醇8000 I.U/kg·d(溶解于大豆油),連續(xù)灌胃十天；對照組灌胃等體積的大豆油。產后72 h經乳頭管灌注LPS10μg/側到第四對乳腺(兩側)內,分別于灌注前(定義為0 h)及灌

6、注后2、4、8、16和24 h(n=6)頸靜脈放血處死動物,采集樣品。試驗結果顯示,視黃醇處理顯著降低了LPS灌注后乳腺組織中Toll樣受體-4(toll-likereceptor-4,TLR-4)、核轉錄因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)p65 mRNA表達,顯著抑制NF-κB與DNA的結合活性,顯著降低乳腺組織中TNF-α與白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的釋放。結果表明,灌胃視

7、黃醇通過降低TLR-4 mRNA的表達,抑制NF-κB p65 mRNA表達及NF-κB與DNA的結合活性,抑制其下游相關炎癥因子TNF-α及IL-1β的過度釋放,減輕炎癥因子對乳腺組織的損傷。
　　 3.視黃醇對試驗性乳腺炎大鼠中性粒細胞活性的影響
　　 為探討視黃醇對試驗性乳腺炎大鼠中性粒細胞活性的影響,72只清潔級SD懷孕大鼠被隨機分為對照組(C,n=36)和試驗組(T,n=36).懷孕第十天起,每天灌胃視黃醇80

8、00 I.U/kg·d(溶解于大豆油),連續(xù)灌胃十天；對照組灌胃等體積的大豆油。產后72 h經乳頭管灌注LPS10μg/側到第四對乳腺(兩側)內。分別于灌注前(定義為0 h)及灌注后2、4、8、16和24 h(n=6)頸靜脈放血處死動物,采集樣品。MPO活力及組織病理學觀察顯示,視黃醇加快了LPS誘發(fā)炎癥的組織修復進程,降低PMN在組織中的積聚與持續(xù)激活,顯著降低LPS灌注后IL-8的釋放,降低乳腺組織與血清中NAGose活力,促進細胞

9、間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的優(yōu)先表達,降低外周血PMN活性氧的釋放。試驗結果表明,灌胃視黃醇能調節(jié)PMN活性,加快PMN的動態(tài)遷徙,降低其活性氧的過度釋放,對PMN引起的氧化應激具有一定的保護作用。
　　 4.大鼠乳腺上皮細胞的優(yōu)化培養(yǎng)及其炎癥反應模型的建立
　　 乳腺上皮細胞是乳腺組織的功能細胞,在受到病原微生物刺激時,乳腺上皮細胞也可產生“自主”

10、抵抗。本研究旨在優(yōu)化大鼠乳腺上皮細胞培養(yǎng)體系,并建立其炎癥反應模型,為進一步深入研究動物乳腺防御機制奠定基礎。選擇妊娠15-18天的健康SD大鼠,無菌采集乳腺組織,分離大鼠乳腺上皮細胞。結果表明通過膠原酶和透明質酸酶聯合消化能成功分離大鼠乳腺上皮細胞,并且在添加了胰島素、轉鐵蛋白、表皮生長因子、氫化可的松等營養(yǎng)因子的DMEM/F12培養(yǎng)液中生長情況良好。對角蛋白及β-酪蛋白的鑒定結果表明,通過此法分離培養(yǎng)的大鼠乳腺上皮細胞純度在95％以

11、上,并具備較好的生物學功能.LPS刺激細胞24 h,TNF-α、IL-1β及誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)mRNA表達均極顯著升高,并且LPS刺激濃度在1-10μg/mL范圍內呈現劑量依賴效應,由于細胞毒性的作用20μg/mL LPS處理時上述細胞因子的表達有輕微下降,但仍顯著高于對照組。10μg/mL LPS刺激顯著提高TNF-α、IL-1β、一氧化氮(nitric ox

12、ide,NO)的釋放。結果表明,本試驗成功建立了大鼠乳腺上皮細胞原代培養(yǎng)體系及其炎癥反應模型。
　　 5.視黃醇對試驗性誘發(fā)的大鼠乳腺上皮細胞炎癥反應的調節(jié)及機制研究
　　 為進一步研究視黃醇對原代培養(yǎng)的大鼠乳腺上皮細胞炎癥反應的調節(jié)及機制,分離并原代培養(yǎng)大鼠乳腺上皮細胞,待細胞鋪滿整個培養(yǎng)瓶的90％,分為對照組和試驗組,試驗組于基礎培養(yǎng)液中添加1μmol/L視黃醇(溶解于DMSO),對照組于基礎培養(yǎng)液中添加等量的DMS

13、O,處理24 h后更換培養(yǎng)液,用10μg/mL的LPS處理細胞,分別于不同時間點收集細胞。LPS能顯著上調大鼠乳腺上皮細胞TLR-4蛋白水平及NF-κB與DNA的結合活性,而視黃醇處理能顯著降低LPS處理后TLR-4蛋白水平,極顯著降低NF-κB與DNA的結合活性。LPS處理大鼠乳腺上皮細胞后引起各個時間點炎性因子TNF—α、IL-1β、中性粒細胞趨化因子-1(cytokine-induced neutrophilchemoattrac

14、tant-1,CINC-1)、iNOS、ICAM-1 mRNA表達極顯著的升高,視黃醇能顯著下調2、4、8、12 h TNF—α mRNA表達,2、4、8 h IL-1β mRNA表達及8、12 h iNOS、ICAM-1 mRNA表達,而對CINC-1 mRNA表達無顯著影響。試驗結果表明,視黃醇預處理通過下調TLR-4/NF-κB信號途徑減輕LPS介導的大鼠乳腺上皮細胞的炎癥反應。
　　 綜上所述,視黃醇能增強大鼠乳腺防御機