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文檔簡(jiǎn)介
1、第一部分:炎癥加重脂質(zhì)誘導(dǎo)的腎臟損傷
目的:探討炎癥是否加重脂質(zhì)誘導(dǎo)的腎臟的損傷。
方法:采用雄性C57BL/6小鼠,將小鼠隨機(jī)分為三組:普通飲食組(A1)、高脂飲食組(B1)、高脂+炎癥組(由皮下注射0.5ml10%酪蛋白(Casein)/隔天誘導(dǎo))(C1)。14周后處死,檢測(cè)血清中IL-6、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的水平。油紅“
2、O”染色及酶法檢測(cè)腎組織內(nèi)脂質(zhì)沉積情況。HE、PAS、Masson染色觀察腎臟形態(tài)學(xué)改變。(Real-timePCR,RT-PCR.)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化技術(shù)(IHC)分別檢測(cè)腎組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)、纖維連接蛋白(FN)、Ⅰ型膠原(CollagenⅠ)、Ⅳ型膠原(CollagenⅣ)的基因與蛋白表達(dá)。
結(jié)果:與B1組比較,C1組血清中的IL-6顯著升高(P<0.05),表明皮下注射Casein成功建立了
3、系統(tǒng)慢性炎癥小鼠模型。與A1組相比,B1組TC、LDL-C顯著升高(P<0.01)。與B1組比較,C1組的血清的TC、LDL-C水平顯著下降(P<0.05),而腎臟組織總膽固醇、膽固醇酯水平顯著升高(P<0.05),病理學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)系膜細(xì)胞的增生和系膜基質(zhì)的擴(kuò)張,GSI顯著增高(P<0.05)。RT-PCR及免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)炎癥上調(diào)了TGF-β1、CollagenⅠ、CollagenⅣ的表達(dá)(P<0.05)。
結(jié)論:炎癥狀態(tài)
4、下,血漿膽固醇水平并不與腎臟損害呈正相關(guān)。炎癥促進(jìn)血清里的膽固醇不斷進(jìn)入腎臟組織細(xì)胞,降低了血清中的脂質(zhì)水平,加重了脂質(zhì)誘導(dǎo)的腎臟損傷。
第二部分:SREBP-LDLr/HMGCOA還原酶途徑在炎癥加重脂質(zhì)誘導(dǎo)腎臟損傷的作用
目的:探討膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白裂解蛋白(SCAP)-膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2(SREBP2)-低密度脂蛋白受體(LDLr)/羥甲基戊二酸單酰CoA還原酶(HMGCoA還原酶)途徑在炎癥
5、加重脂質(zhì)誘導(dǎo)的腎臟損傷中的作用。
方法:在第一部分研究的動(dòng)物模型上,RT-PCR檢測(cè)SCAP,SREBP2、HMGCoA還原酶和LDLr基因水平,Western blot(WB)檢測(cè)相應(yīng)蛋白表達(dá)量。有相關(guān)趨勢(shì)的變量采用Pearson相關(guān)分析。
結(jié)果:與B2組相比,C2組SCAP,SREBP2、HMGCoA還原酶和LDLr基因與蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05),并且HMGCoA還原酶和LDLr蛋白的表達(dá)與腎臟組
6、織沉積的膽固醇酯(CE)成正相關(guān)(P<0.05)。
結(jié)論:炎癥可以通過(guò)上調(diào)SCAP-SREBP2-LDLr/HMGCoA還原酶的表達(dá),促進(jìn)膽固醇的合成和攝取,加重了脂質(zhì)在腎臟的沉積,加重誘導(dǎo)了腎臟的損傷。
第三部分:炎癥加重SR-A/CD36/ApoE三敲小鼠脂質(zhì)誘導(dǎo)的腎臟損傷及主要機(jī)制
目的:應(yīng)用SR-A/CD36/ApoE三敲除小鼠模型,旨在探討清道夫受體CD36、SR-A及LDLr在炎癥加
7、重脂質(zhì)介導(dǎo)的腎臟損傷的作用。
方法:C57BL/6來(lái)源的雄性SR-A/CD36/ApoE三敲除小鼠,將小鼠隨機(jī)分為三組:普通飲食組(A2)、高脂飲食組(B2)、高脂+炎癥組(C2)。14周后處死,檢測(cè)血清中淀粉樣蛋白(SAA)、IL-6、肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、TC、TG、LDL-C、和HDL-C水平。檢測(cè)尿蛋白/尿肌酐的水平。油紅“O”染色及酶法檢測(cè)腎組織內(nèi)脂質(zhì)沉積情況。HE,PAS,Masson方法觀察腎臟形
8、態(tài)學(xué)改變。RT-PCR技術(shù)檢測(cè)腎組織TGF-β1、FN、CollagenⅠ、CollagenⅣ、a肌動(dòng)蛋白(a-SMA)、LDLr、SREBP2、SCAPmRNA表達(dá)。IHC與WB技術(shù)檢測(cè)TGF-β1、FN、CollagenⅠ、CollagenⅣ、a-SMA、LDLr、SREBP2-N、SCAP蛋白表達(dá)。
結(jié)果:C2組血清炎癥因子SAA,IL-6顯著高于B2及A2組,表明炎癥模型成功建立(P<0.05)。C2組血清中TC、
9、LDL-C、HDL-C顯著低于B2組(P<0.05),腎臟膽固醇,膽固醇酯的沉積卻顯著升高(P<0.05),血清Scr,BUN,尿蛋8/尿肌酐顯著升高(P<0.05)。腎臟病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)C2組腎小球基底膜增厚,腎小管上皮細(xì)胞變性萎縮,蛋白管型及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等改變,GSI、TII顯著高于B2組(P<0.05)。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)炎癥上調(diào)了腎臟CollagenⅠ、CollagenⅣ、a-SMA、TGF-β1、FN mRNA與蛋白的表達(dá)(P<0.
10、05)。炎癥還顯著促進(jìn)了LDLr、SCAP、SREBP2mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)(P<0.05)。
結(jié)論:炎癥可以通過(guò)SREBP2-SCAP-LDLr途徑而非CD36/SR-A途徑促進(jìn)了脂質(zhì)從血清向腎臟的積聚,加重了脂質(zhì)誘導(dǎo)的腎臟損害。
第四部分:阿托伐他汀非依賴(lài)降血脂的腎臟的保護(hù)作用
目的:探討阿托伐他汀的腎臟保護(hù)作用及潛在機(jī)制。
方法:在第三部分實(shí)驗(yàn)的同時(shí),采用SR-A/CD36
11、/ApoE三敲除小鼠設(shè)立高脂飲食+2mg/kg/d阿托伐他?。―1)組,以A1、A2組為對(duì)照,B2組為模型組。檢測(cè)血清IL-6、SAA的水平及脂質(zhì)水平。油紅“O”染色及酶法檢測(cè)’腎組織內(nèi)脂質(zhì)沉積情況。HE,PAS,Masson染色觀察腎臟形態(tài)學(xué)改變。RT-PCR與IHC分別檢測(cè)腎組織TGF-β1、FN、CollagenⅠ、CollagenⅣ、a-SMA的基因與蛋白表達(dá)。
結(jié)果:與B2組比較,D1組顯著減少了腎臟組織膽固醇、
12、膽固醇酯沉積(P<0.05),顯著改善了蛋白尿與腎功能(P<0.05),但是血清中的TC、LDL-C水平無(wú)顯著的降低(P>0.05)。與B2組比較,D1組可以顯著減少高脂飲食誘導(dǎo)的腎臟組織系膜細(xì)胞的增生,系膜基質(zhì)的沉積等病理改變,GSI顯著降低(P<0.05)。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)D1組顯著降低了腎臟組織TGF-β1的基因與蛋白表達(dá)(P<0.05),進(jìn)而顯著降低FN、CollagenⅠ、CollagenⅣ、a-SMA的基因與蛋白表達(dá)(P<0.
13、05)。
結(jié)論:阿托伐他汀可以不依賴(lài)于降血脂,而是通過(guò)降低腎臟組織TGF-β1,獨(dú)立于SRA、CD36受體途徑而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。
第五部分:炎癥應(yīng)激導(dǎo)致他汀抵抗作用
目的:本課題組體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明炎癥可以導(dǎo)致肝臟細(xì)胞對(duì)他汀藥物的抵抗,本部分將從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討炎癥反應(yīng)是否影響阿托伐他汀的腎臟保護(hù)作用。
方法:在第三部分實(shí)驗(yàn)的同時(shí),對(duì)高脂+炎癥模型的小鼠加用阿托伐他汀2mg/kg
14、/d(D2)和10mg/kg/d(D3)干預(yù)實(shí)驗(yàn),以A2、D1、B2、C2組為對(duì)照,酶法檢測(cè)血清的TC、LDL-C、TG、HDL-C水平與SAA、IL-6水平。HE、PAS、Masson染色方法觀察腎臟形態(tài)學(xué)改變,酶法及油紅“O”染色檢測(cè)腎臟組織中膽固醇的沉積。RT-PCR檢測(cè)腎組織TGF-β1、FN、CollagenⅠ、CollagenⅣ、a-SMA的基因表達(dá)。
結(jié)果:與C2組對(duì)比,D2、D3組不能有效降低血脂水平(P>
15、0.05)。與B2比較,D3組可以顯著降低血脂水平(P<0.05)。與C2組對(duì)比,D2組不能顯著的降低腎臟組織膽固醇的沉積、血清肌酐水平(P>0.05)及改善腎臟病理結(jié)構(gòu)的損傷,D3組可顯著降低腎臟組織膽固醇的沉積及改善腎臟的病理(P<0.05)。并且,D2組不能顯著降低CoilagenⅠ、CollagenⅣ基因的表達(dá)(P>0.05),而D3組能顯著降低FN、CollagenⅠ、CollagenⅣ、a-SMA所有基因的表達(dá)(P<0.05
16、)。
結(jié)論:炎癥影響阿托伐他汀腎臟保護(hù)作用的療效,在炎癥環(huán)境中要達(dá)到相同效果需要增大劑量。而導(dǎo)致這個(gè)現(xiàn)象的潛在機(jī)制值得進(jìn)一步探討。
第六部分:重慶漢族兒童單核細(xì)胞趨化蛋白-1基因多態(tài)性及表達(dá)水平與結(jié)核病易感性的關(guān)系
目的:探討MCP-1基因啟動(dòng)子區(qū)2518A/G多態(tài)性、血清MCP-1蛋白表達(dá)水平與結(jié)核病的相關(guān)關(guān)系。
方法:研究對(duì)象為100例兒童結(jié)核病、100例成人結(jié)核病以及相應(yīng)的2
17、00例健康對(duì)照。序列特異性引物PCR(PCR-SSP)技術(shù)檢測(cè)MCP-1基因啟動(dòng)子區(qū)2518A/G多態(tài)性。ELISA方法測(cè)定相應(yīng)不同基因型患者和對(duì)照血清MCP-1水平。
結(jié)果:(1)總體結(jié)核病組2518GG基因型頻率為65%,明顯高于相應(yīng)的健康對(duì)照組(27%)(P<0.05);(2)MCP-1基因啟動(dòng)子區(qū)2518位點(diǎn)GG基因型患結(jié)核病機(jī)率高于AA基因型,且兒童GG基因型發(fā)病的危險(xiǎn)性高于成人GG基因型(P<0.05);(3)
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