LSDP5在肝臟脂肪和脂滴代謝中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　脂肪肝（liversteatosisorfattyliver）是各種病因造成脂肪代謝異常時(shí)最為常見(jiàn)的一種肝臟疾病，在我國(guó)約20％～30％的人患有脂肪肝。脂肪肝的典型病理變化是肝細(xì)胞內(nèi)過(guò)多中性脂肪（neutrallipid）儲(chǔ)積，并出現(xiàn)脂滴（lipiddroplet，LD）。目前對(duì)脂肪肝的病因研究較多，但對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)脂滴代謝和形成的研究較少。脂滴（LD）早期被認(rèn)為僅僅是一個(gè)類(lèi)似于糖原的能量?jī)?chǔ)存結(jié)構(gòu)，但是目前研究表明，脂

2、滴并非細(xì)胞內(nèi)一個(gè)簡(jiǎn)單的能量貯存器，而是一個(gè)復(fù)雜的、活動(dòng)旺盛、動(dòng)態(tài)變化的多功能細(xì)胞成分。脂滴可能在脂類(lèi)代謝與存儲(chǔ)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白降解，以及信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中均起著重要的作用。脂滴表面鑲嵌著多種脂滴蛋白（lipiddropletproteins，LDP），其對(duì)脂滴的穩(wěn)定性和代謝過(guò)程均具有非常重要的作用。目前，在所有脂滴蛋白中，PAT家族成員是最為重要，也是研究最多的一組分子。PAT家族主要包括perilipin、adipophilin、TIP47

3、（tail-interactingproteinof47kDa）、S3-12以及LSDP5（lipidstoragedropletprotein5）。其中LSDP5是PAT家族第五個(gè)成員，主要分布于脂肪分解代謝速度較快的組織中，如肝臟、心肌、骨骼肌等，因此又稱(chēng)為OXPAT（oxidativetissue-enrichedPATprotein）/PAT-1或MLDP（myocardiallipiddropletprotein），但是其具體

4、作用及機(jī)制目前尚不明確。
　　研究目的：
　　本研究擬確定LSDP5的亞細(xì)胞定位；通過(guò)構(gòu)建LSDP5的截短體，分析LSDP5各個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能；確定LSDP5對(duì)肝細(xì)胞脂滴數(shù)量和大小、甘油三酯的合成和分解的影響，明確LSDP5對(duì)肝細(xì)胞脂肪代謝的作用；確定LSDP5的相互作用分子，分析LSDP5對(duì)脂滴代謝相關(guān)分子表達(dá)的影響，闡明LSDP5對(duì)肝脂肪代謝影響可能的分子機(jī)制。
　　研究方法：
　　1、利用免疫熒光的方法明確L

5、SDP5在肝細(xì)胞內(nèi)的分布與亞細(xì)胞定位；
　　2、在肝細(xì)胞系和原代肝細(xì)胞中改變LSDP5的表達(dá)，觀察其對(duì)肝細(xì)胞脂滴形態(tài)和脂代謝的影響。
　　3、以LSDP5為誘餌蛋白，通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)來(lái)篩選與之相互作用分子。并進(jìn)一步通過(guò)免疫共沉淀和免疫熒光共定位驗(yàn)證其相互作用，以相互作用的分子為線索，最終闡明LSDP5的分子功能。
　　研究結(jié)果：
　　1、LSDP5是一個(gè)脂滴表面蛋白（LDP）。
　　使用免疫熒光技術(shù)，我們

6、發(fā)現(xiàn)LSDP5定位在脂滴表面。構(gòu)建LSDP5截短體，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)LSDP5的N端，含有PAT家族保守性的PAT-1區(qū)和11-merα-螺旋的重復(fù)序列，是LSDP5脂滴定位的關(guān)鍵部位。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量測(cè)定結(jié)果提示，LSDP5的N端也是影響脂滴儲(chǔ)積的關(guān)鍵區(qū)域。2、LSDP5增加肝細(xì)胞內(nèi)中性脂肪的儲(chǔ)積。
　　在肝細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)LSDP5，利用NileRed熒光染料顯示肝細(xì)胞內(nèi)脂滴的形態(tài)和數(shù)量。結(jié)果表明LSDP5能夠明顯增加肝細(xì)胞

7、內(nèi)大脂滴的比例，提高細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的含量。LSDP5的沉默使細(xì)胞內(nèi)的脂滴增大受到明顯的抑制，胞漿內(nèi)脂滴明顯變小，肝細(xì)胞中甘油三酯含量也明顯降低。
　　3、LSDP5可以影響脂肪分解和脂肪酸的氧化，并與具有脂肪分解作用的蛋白ES1（esterase1）存在相互作用。
　　LSDP5的沉默刺激脂肪分解，上調(diào)甘油三酯分解速率和脂肪分解相關(guān)酶的轉(zhuǎn)錄，增加脂肪酸β氧化速率和線粒體的數(shù)目。通過(guò)酵母雙雜交，我們篩選出了與LSDP5相互作用

8、的分子ES1。ES1是一個(gè)在肝臟高表達(dá)的65KD的糖蛋白，它能夠水解許多的酯類(lèi)，包括甘油三酯和其他的脂肪酸酯。進(jìn)一步應(yīng)用免疫共沉淀和免疫熒光共定位，我們證明LSDP5能夠與ES1相互作用。
　　結(jié)論：
　　本研究證實(shí)LSDP5是一個(gè)定位于脂滴表面的蛋白質(zhì)，可以促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)脂滴的增大和甘油三酯的儲(chǔ)積。其機(jī)制可能是通過(guò)LSDP5與ES1的相互作用，抑制ES1對(duì)于甘油三酯的水解，并進(jìn)一步減少脂肪酸的β氧化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。抑制LSDP5的