中碳鏈脂肪酸改善脂變肝細(xì)胞損傷和脂代謝紊亂的機(jī)制.pdf

1、隨著人們物質(zhì)生活水平的提高以及體育活動(dòng)的減少，導(dǎo)致肥胖及其相關(guān)代謝疾病的發(fā)病率顯著增加，繼而損傷機(jī)體的健康。所以，近年來尋求一種綠色高效的減肥手段一貫被研究者所重視。然而膳食油脂作為引起體內(nèi)脂質(zhì)沉淀的主要原因，對(duì)機(jī)體的生物學(xué)作用和內(nèi)在分子機(jī)制不甚清楚。
　　本論文采用組合生物學(xué)技術(shù)，對(duì)非酒精性脂肪肝?。∟AFLD)細(xì)胞模型的建立、脂肪酸（FA)對(duì)該模型細(xì)胞凋亡、氧化壓力、免疫調(diào)控和脂質(zhì)代謝的分子作用機(jī)制進(jìn)行了非常全面的探討。采用M

2、TT細(xì)胞活性檢測(cè)法、LDH細(xì)胞壞死檢測(cè)法、Hoechst33342染色對(duì)細(xì)胞凋亡測(cè)定法、油紅O染色法和甘油三酯（TG)定量測(cè)定法、掃描電鏡對(duì)細(xì)胞膜損傷程度檢測(cè)法對(duì)建立符合人類自然病規(guī)律的NAFLD模型（最大脂質(zhì)沉淀和較低的細(xì)胞毒性）的條件進(jìn)行了探索。采用檢測(cè)細(xì)胞凋亡的Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞儀法(FCM)和 Hoechst33342/PI熒光顯微鏡法、細(xì)胞的抗氧化及氧化壓力的酶標(biāo)儀測(cè)定法、差異蛋白測(cè)定的蛋白組學(xué)法

3、、WB以及ELISA結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)考察了免疫因子的表達(dá)，研究膳食中FA的種類對(duì)人肝脂變細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)控和氧化壓力的影響，探究促進(jìn)NAFLD到進(jìn)一步肝損傷的機(jī)制。采用MTT細(xì)胞活性檢測(cè)法、油紅O染色和TG定性定量測(cè)定法以及脂代謝基因型熒光定量PCR、ELISA與WB相結(jié)合的方法，對(duì)中碳鏈脂肪酸(MCFA)對(duì)NAFLD細(xì)胞脂滴的聚集及相關(guān)脂代謝的分子作用機(jī)制進(jìn)行了全面的探究。
　　本研究的主要結(jié)果總結(jié)如下：
　　第1章

4、緒論部分對(duì)MCFA的生物學(xué)特性和NAFLD的研究進(jìn)展分別做了綜述，并對(duì)引起NAFLD的分子作用機(jī)制作出了展望。FA生物學(xué)特性，包括FA的代謝特點(diǎn)、生理功能、安全性和潛在的局限性的研究進(jìn)展。NAFLD研究部分包括該病發(fā)病的原因、模型的建立、引起的細(xì)胞凋亡、氧化壓力、免疫調(diào)控和相關(guān)脂代謝信號(hào)通路的研究進(jìn)展。
　　第2章對(duì)建立符合人類自然疾病規(guī)律的NAFLD模型的最適條件進(jìn)行了探索。通過MTT和LDH相互驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)方法考察混合FA(油酸

5、：棕櫚酸=2：1)和單一FA(油酸）對(duì)LO2和HepG2兩種肝細(xì)胞的增殖與凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FA對(duì)細(xì)胞的毒性均產(chǎn)生濃度和時(shí)間依賴性，當(dāng)濃度低于400μM時(shí)，不會(huì)對(duì)細(xì)胞的活性存在影響，且LO2細(xì)胞對(duì)FA的毒性影響較HepG2肝細(xì)胞更加敏感。進(jìn)一步通過Hoechst染色法對(duì)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)結(jié)果說明細(xì)胞凋亡的程度與FA的濃度呈正相關(guān)，在濃度小于400μM時(shí)，與對(duì)照組相比均不會(huì)明顯引起細(xì)胞的凋亡；濃度升高到800μM時(shí)，均可引起細(xì)胞的毒性。通過

6、油紅O染色定性觀察細(xì)胞內(nèi)的脂滴及細(xì)胞的形態(tài)，磷酸甘油氧化酶法定量對(duì)胞里TG含量的測(cè)定，結(jié)果表明FA混合物相對(duì)于單一FA更適合用來建立肝脂變細(xì)胞模型；當(dāng)混合FA與LO2細(xì)胞孵育時(shí)間為24h，作用終濃度為200μM時(shí)，到達(dá)最高的脂質(zhì)沉淀且造成的肝細(xì)胞慢性損傷和NAFLD的慢性肝脂肪變接近。
　　第3章通過研究膳食中FA的種類對(duì)人肝脂變細(xì)胞凋亡和氧化壓力的影響，探究促進(jìn)NAFLD到進(jìn)一步肝損傷的機(jī)制。通過對(duì)細(xì)胞凋亡分析表明：同LCFA對(duì)

7、比，MCFA能顯著降低早、中、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的百分比，同時(shí)抑制Caspase3和Caspase9酶的活性。氧化分析結(jié)果表明：采用蛋白雙向電泳及二級(jí)質(zhì)譜方法研究發(fā)現(xiàn)LCFA能抑制抗氧化酶的產(chǎn)生；進(jìn)一步通過對(duì)SOD、MDA、GSH和ROS的測(cè)定也發(fā)現(xiàn)MCFA不會(huì)產(chǎn)生氧化壓力，而LCFA會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生氧化壓力。本章結(jié)果表明：通過改變膳食中F A的種類可抑制肝脂變細(xì)胞的進(jìn)一步損傷，不會(huì)促進(jìn)該病的進(jìn)一步惡化。
　　第4章通過檢測(cè)膳食中

8、FA的種類對(duì)人肝脂變細(xì)胞免疫調(diào)控的影響，探究促進(jìn)NAFLD到進(jìn)一步肝炎的發(fā)病機(jī)制。通過對(duì)NO和iNOS測(cè)定分析表明：MCFA組與NR組對(duì)比不會(huì)引起NO和iNOS水平增加，LCFA亦不會(huì)引起NO和iNOS的顯著增加。細(xì)胞免疫分析表明：MCFA不能促進(jìn)IL-6、IL-1-β和TNF-α經(jīng)典免疫因子的分泌，而LCFA具有類似LPS的作用，能顯著提高上述免疫因子的產(chǎn)生。本章結(jié)果表明：FA引起肝脂變細(xì)胞的凋亡不依賴于NO和iNOS途徑，且LCFA

9、能強(qiáng)烈引起細(xì)胞的免疫應(yīng)答，攝入含MCFA的油脂對(duì)NAFLD的進(jìn)一步惡化為NASH起著積極的作用。
　　第5章脂質(zhì)在肝臟中過量沉積會(huì)引起肝細(xì)胞功能的紊亂，進(jìn)而促進(jìn)脂肪肝的形成危害機(jī)體的健康，但引起脂滴在肝細(xì)胞里聚集的機(jī)制仍未能得到明確的解釋。本章探究MCFA對(duì)NAFLD細(xì)胞中脂質(zhì)代謝的影響，試圖尋找日常飲食中脂肪的替代品。油紅O染色和TG檢測(cè)實(shí)驗(yàn)暗示：與LCFA(油酸，C18:1)對(duì)比，MCFA可顯著降低肝脂變LO2細(xì)胞內(nèi)脂滴的積累

10、，具有類似吉非羅齊藥物的降脂效果。RT-PCR和W B的研究結(jié)果表明：MCFA通過下調(diào)LPL、FAS、ACC、LXR-α、CD36和SREBP-1脂肪生成基因的在肝脂變細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)ATGL和HSL加速脂肪氧化分解基因的表達(dá)，從而使細(xì)胞內(nèi)TG的聚集得到改善，最終使肝細(xì)胞的脂肪變程度得到緩和。
　　第6章結(jié)論與展望部分對(duì)MCFA對(duì)NAFLD細(xì)胞模型細(xì)胞凋亡、抗氧化體系、免疫調(diào)控和脂質(zhì)代謝的分子作用機(jī)制進(jìn)行了歸納，對(duì)后續(xù)研究工