PI3K-Akt對(duì)飽和脂肪酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及脂性凋亡的影響.pdf

1、研究背景與目的：
　　非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是除酒精和其他明確因素引起的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)量蓄積而導(dǎo)致的一種慢性代謝性疾病。近年來(lái)我國(guó)人民生活水平不斷提高，NAFLD的發(fā)病率也日益升高，現(xiàn)已成為嚴(yán)重威脅我國(guó)人民健康的主要疾病之一。NAFLD主要指單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（ nonalcoholic steatohepatitis，NASH）以及脂肪性肝

2、硬化。其中NASH是影響NAFLD患者預(yù)后的重要環(huán)節(jié)[1]。大量研究表明肝細(xì)胞凋亡在 NASH發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到了重要的作用[2-3]。其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ endoplasmic reticulum stress，ERS）與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[4]。但是，NASH肝細(xì)胞凋亡中ERS的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，飽和脂肪酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性，肝細(xì)胞發(fā)生脂性凋亡，與既往有關(guān)NASH的研究一致[5-6]。我們的研究還證實(shí)，飽

3、和脂肪酸能夠通過(guò)ERS UPR(unfolded protein response)和非UPR（non-unfolded protein response）信號(hào)途徑誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂性凋亡，CHOP、Bax分別是軟脂酸鈉誘導(dǎo)的脂變細(xì)胞發(fā)生ERS中UPR和非UPR的凋亡執(zhí)行信號(hào)分子[7-8]。據(jù)報(bào)道，PI3K/Akt通路可抑制毒胡蘿卜素誘導(dǎo) ERS過(guò)程中 CHOP和Bax的表達(dá)[9-10]。目前有關(guān)PI3K/Akt通路是否參與對(duì)飽和脂肪酸誘導(dǎo)的

4、肝細(xì)胞內(nèi)ERS UPR和非UPR信號(hào)途徑中CHOP和Bax調(diào)控的研究鮮有報(bào)道。本研究以飽和脂肪酸誘導(dǎo) L02、HepG2細(xì)胞，構(gòu)建肝細(xì)胞脂變模型，觀察脂變肝細(xì)胞PI3K/Akt以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子的表達(dá)，探討PI3K/Akt通路對(duì)脂變肝細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激UPR和非UPR信號(hào)途徑的調(diào)控以及脂性凋亡的影響。
　　方法
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)：將人肝L02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞分別用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基（含青霉素0.0

5、625g/L，鏈霉素0.1g/L）、含10%胎牛血清的高糖 DMEM培養(yǎng)基（含青霉素0.0625g/L，鏈霉素0.1g/L）培養(yǎng)。
　　2、實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組（不加藥物的普通培養(yǎng)基）、模型組（軟脂酸鈉組，培養(yǎng)基中加入最佳實(shí)驗(yàn)濃度的軟脂酸鈉）和干預(yù)組（抑制劑組，在培養(yǎng)基中加入軟脂酸鈉前1h預(yù)先加入 PI3K/Akt抑制劑LY294002）。
　　3、MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力，甘油三酯（TG）試劑盒和油紅 O染色了解肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積

6、情況。
　　4、CCK8比色法檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western Blot法檢測(cè)各組肝細(xì)胞葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein78， GRP78）、PI3K、磷酸化磷脂酰肌醇-3激酶（p-PI3K）、Akt1、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt1）、CHOP和Bax的表達(dá)情況。
　　結(jié)果
　　第一部分
　　1、軟脂酸鈉最佳作用濃度的篩選：通過(guò)MTT法檢測(cè)24h、48h

7、下54、108、126、144、162、216μmol/L濃度軟脂酸鈉作用于L02、HepG2細(xì)胞的細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示，當(dāng)超過(guò)108μmol/L的軟脂酸鈉刺激肝細(xì)胞48h后的細(xì)胞存活率較對(duì)照組明顯降低，當(dāng)濃度超過(guò)144μmol/L的軟脂酸鈉刺激肝細(xì)胞48h后細(xì)胞存活率低于50%。結(jié)合前期研究結(jié)果[7]，選用108μmol/L作為軟脂酸鈉最佳誘導(dǎo)濃度。
　　2、肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)檢測(cè)：
　?。?）TG含量測(cè)定：L02細(xì)胞模型組和對(duì)

8、照組24、48h甘油三酯含量分別為50.2±3.3 vs20.3±3.0，67.4±3.8 vs20.8±3.4；HepG2細(xì)胞模型組和對(duì)照組24、48h甘油三酯含量分別為42.1±3.3 vs18.1±2.7，64.6±2.9 vs20.4±2.8。肝細(xì)胞中TG含量隨著軟脂酸鈉誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，與對(duì)照組相比，各時(shí)間點(diǎn)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?）油紅O染色顯示：與對(duì)照組相比，隨軟脂酸鈉作用時(shí)間的延長(zhǎng)，

9、模型組肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)橘紅色脂滴逐漸增多，甚至出現(xiàn)融合現(xiàn)象。
　　3、肝細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)：Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，L02細(xì)胞24h和48h對(duì)照組、模型組凋亡率（%）分別為4.41±0.78 vs6.01±1.49，12.56±2.78 vs29.72±6.39。HepG2細(xì)胞24h和48h對(duì)照組、模型組凋亡率（%）分別為11.16±1.15 vs17.50±6.83，22.37±1.24 vs33.85±5.79。

10、肝細(xì)胞凋亡率隨軟脂酸鈉誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，48h模型組肝細(xì)胞凋亡率較48h對(duì)照組明顯增加（P<0.05）。
　　4、Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)GRP78、PI3K、p-PI3K、Akt1、p-Akt1、CHOP和Bax蛋白的表達(dá)情況：
　?。?）隨著軟脂酸鈉誘導(dǎo)肝細(xì)胞時(shí)間的延長(zhǎng)（0、12、24、48h）， L02細(xì)胞GRP78蛋白的表達(dá)量逐漸增加，HepG2細(xì)胞GRP78蛋白的表達(dá)于24h達(dá)到高峰，24h后稍有

11、下降，模型組肝細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?）軟脂酸鈉誘導(dǎo)L02和HepG2細(xì)胞0、12、24、48h，PI3K和Akt1蛋白表達(dá)量無(wú)明顯改變（P>0.05）。而p-PI3K和p-Akt1蛋白的表達(dá)先上調(diào)后下調(diào)，表現(xiàn)為24h內(nèi)逐漸升高，24h后降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?）軟脂酸鈉誘導(dǎo) L02和 HepG2細(xì)胞0、12、24、48h，CHOP和 B

12、ax的表達(dá)以時(shí)間依賴的方式上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　第二部分
　　1、篩選LY294002的最佳干預(yù)濃度：不同濃度LY294002（L02細(xì)胞：0.10、0.25、0.50、1.00、2.00μmol/L；HepG2細(xì)胞：4、5、6、8、10μmol/L）預(yù)處理肝細(xì)胞后，加入最佳作用濃度的軟脂酸鈉孵育24、48h，CCK8法檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)合Western blot結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，選用0.50μ

13、mol/L（L02細(xì)胞）和5μmol/L（HepG2細(xì)胞）作為后續(xù)試驗(yàn)中LY294002的干預(yù)濃度。
　　2、Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，L02細(xì)胞24h和48h對(duì)照組、模型組、干預(yù)組凋亡率（%）分別為4.41±0.78 vs6.01±1.49 vs19.50±2.53，12.56±2.78 vs29.72±6.39 vs47.60±4.17。HepG2細(xì)胞24h和48h對(duì)照組、模型組、干預(yù)組凋亡率（%）分別為11

14、.16±1.15 vs18.17±3.16 vs30.41±3.62，22.37±1.24 vs33.85±1.20 vs58.56±4.21。肝細(xì)胞凋亡率隨軟脂酸鈉誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，與對(duì)照組相比，48h模型組肝細(xì)胞凋亡率明顯增加，各時(shí)間點(diǎn)（24、48h）干預(yù)組細(xì)胞凋亡率與對(duì)應(yīng)模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3、使用LY294002干預(yù)后，Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)GRP78、PI3K、p-PI

15、3K、Akt1、p-Akt1、CHOP和Bax蛋白的表達(dá)情況：
　?。?）隨著軟脂酸鈉誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)（0、12、24、48h），L02、HepG2細(xì)胞干預(yù)組p-PI3K、p-Akt1的表達(dá)均為先上調(diào)后下調(diào)，而與各時(shí)間點(diǎn)模型組相比，干預(yù)組p-PI3K、p-Akt1的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。對(duì)照組、模型組、干預(yù)組PI3K和Akt1蛋白表達(dá)量無(wú)明顯改變（P>0.05）。
　?。?）L02細(xì)胞干預(yù)組GRP78

16、蛋白表達(dá)隨著軟脂酸鈉誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)呈時(shí)間依賴性增加，HepG2細(xì)胞干預(yù)組GRP78蛋白的表達(dá)于24h達(dá)到高峰，24h后稍有下降，但兩組細(xì)胞GRP78蛋白的表達(dá)均較各時(shí)間點(diǎn)模型組的表達(dá)明顯增高（P<0.05）。
　?。?）L02、HepG2細(xì)胞干預(yù)組 CHOP、Bax蛋白表達(dá)隨著軟脂酸鈉誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)呈時(shí)間依賴性增高，且較各時(shí)間點(diǎn)模型組的表達(dá)明顯增高（P<0.05）。
　　結(jié)論
　　1、飽和脂肪酸誘導(dǎo)L02和HepG2細(xì)胞發(fā)