ob-ob小鼠肝臟脂代謝及鋅alpha2糖蛋白在脂肪細(xì)胞線粒體合成中的作用.pdf

1、目的：觀察ob/ob小鼠肝臟鋅alpha2糖蛋白（Zinc-alpha2-glycoprotein，ZAG）及脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況，初步探討ZAG是否參與ob/ob小鼠非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)生發(fā)展。
　　方法：8周齡野生型（wild type，WT）C57BL/6J雄性健康小鼠36只，雄性ob/ob小鼠22只，均給予標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，每籠2-4只，飼

2、養(yǎng)期間隔日更換墊料，每天補(bǔ)充飼料與飲用水，觀察小鼠體型、毛發(fā)、活動、進(jìn)食、進(jìn)水及尿量等一般情況。2周后按空腹體重從野生型中隨機(jī)選擇8只設(shè)為 WT組，從 ob/ob小鼠中隨機(jī)選擇8只設(shè)為ob/ob組。收集血清及肝臟組織，對2組小鼠進(jìn)行體重、肝指數(shù)、肝臟TG(Triglyceride，TG)、血清ALT、AST測定；同時取部分肝臟組織固定行 H&E染色觀察肝臟組織病理學(xué)變化；RT-qPCR檢測肝臟ZAG mRNA表達(dá)水平；Western b

3、lotting檢測肝臟ZAG及脂代謝相關(guān)基因的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：與WT組相比，ob/ob組小鼠體積明顯增大，體重、肝指數(shù)顯著增加（P?0.01）；ob/ob組小鼠肝臟體積明顯增大，肝脂肪變明顯；肝臟TG，血清ALT、AST水平明顯升高（P?0.01）；在mRNA水平，肝臟組織ZAG的表達(dá)降低（P?0.05）；在蛋白水平，肝臟ZAG的表達(dá)明顯降低（P?0.01），肝臟脂肪分解相關(guān)基因法尼酯衍生物 X受體(farnesoid

4、X receptor，F(xiàn)XR)、肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1（carnitine palmitoyltransferase，CPT1）表達(dá)水平降低（P?0.05），過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptorα，PPARα)的蛋白表達(dá)水平顯著降低（P?0.01）；而脂肪合成相關(guān)基因肝臟X受體（Liver X receptorα，LXRα）、固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白(sterol r

5、egulatory element binding protein-1c，SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)、乙酰輔酶 A羧化酶α（Acetyl CoA carboxylase a，ACCα）的表達(dá)水平均顯著升高（P?0.01）；參與糖酵解的關(guān)鍵酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的表達(dá)水平顯著升高（P?

6、0.01）。
　　結(jié)論：ob/ob小鼠肝臟ZAG及脂肪分解相關(guān)基因FXR、PPARα、CPT1的表達(dá)水平降低，脂肪合成相關(guān)基因LXRα、SREBP-1c、FAS、ACCα的表達(dá)水平升高。
　　目的：觀察重組2型腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associated virus-2，rAAV2）介導(dǎo)的鋅alpha2糖蛋白對脂肪細(xì)胞線粒體生物合成相關(guān)因子的影響。
　　方法：1.3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)

7、分化：用含10％胎牛血清(FBS)的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞，接種六孔板待匯合度100%后繼續(xù)培養(yǎng)1-2天，之后采用“雞尾酒”法誘導(dǎo)分化，即先用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅰ培養(yǎng)3天，再用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅱ培養(yǎng)3天后更換新的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅱ維持2天，油紅 O染色對脂肪細(xì)胞進(jìn)行鑒定，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及脂質(zhì)聚集情況。2.感染復(fù)數(shù)（MOI:multiplicity of infection）及感染時間的確定：采用不同MOI(2×104、1

8、×105、5×105 v.g./cell）的空載體2型腺相關(guān)病毒rAAV2-EGFP感染誘導(dǎo)分化成熟的脂肪細(xì)胞，感染后每隔24h在熒光顯微鏡下觀察熒光細(xì)胞的數(shù)量。3.選取最佳MOI值及時間，用重組2型腺相關(guān)病毒rAAV2-ZAG及空病毒再次感染分化成熟的脂肪細(xì)胞72h，油紅O染色觀察比較脂質(zhì)聚集情況，Western blotting檢測ZAG、解偶聯(lián)蛋白-1（Uncoupling protein-1，UCP-1）以及線粒體生物合成相關(guān)因

9、子的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1.誘導(dǎo)第4天倒置顯微鏡下觀察可見胞漿內(nèi)出現(xiàn)少量脂滴，第6天細(xì)胞逐漸回縮變圓，脂滴融合變大，誘導(dǎo)分化第10天，80%的3T3-L1前脂肪細(xì)胞已分化，細(xì)胞呈圓形或類圓形，胞漿中含有大量大小不等的脂滴，脂滴聚集于核周，形成典型的“戒環(huán)樣”結(jié)構(gòu)；油紅 O染色可見脂肪細(xì)胞脂滴被染成橘紅色，清晰可見。2.當(dāng) MOI值取5×105 v.g./cell且感染72h時，含熒光的細(xì)胞數(shù)量最多；與對照組（MOI=0）相比，當(dāng)

10、MOI值取5×105 v.g./cell且感染72h時，ZAG蛋白表達(dá)水平最高，差異顯著（P?0.01）。3.油紅 O染色可見，與感染空病毒組相比，rAAV2-ZAG組脂肪細(xì)胞中的脂滴被體積更小的微團(tuán)塊取代，邊緣模糊不清；Western blotting可見，與空病毒組相比，rAAV2-ZAG組目的基因ZAG在脂肪細(xì)胞中成功過表達(dá)（P?0.05）；rAAV2-ZAG組 UCP-1表達(dá)升高，且差異顯著（P?0.01）；與空白病毒組相比，r