鋅alpha2糖蛋白對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)TG沉積的影響.pdf

1、第一部分：
　　目的：觀察棕櫚酸（palmitic acid，PA）對(duì)HepG2和Hepa1-6細(xì)胞中鋅alpha2糖蛋白（Zinc alpha2 glycoprotein，ZAG）及法尼酯受體（Farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）表達(dá)的影響以及探討HepG2細(xì)胞過表達(dá)ZAG后對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的TG沉積的影響。
　　方法：1.體外培養(yǎng)HepG2和Hepa1-6細(xì)胞，用濃度分別為0mM、0.2mM、0.4mM、0.6

2、mM的棕櫚酸分別干預(yù)HepG2和Hepa1-6細(xì)胞24小時(shí)，Western blot在蛋白水平檢測(cè)ZAG及FXR表達(dá)。
　　2.用六孔板體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，用過表達(dá)ZAG質(zhì)粒和空質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞24h后，0.4mM棕櫚酸干預(yù)24h，采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的水平,油紅 O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴，Western blot在蛋白水平檢測(cè)代謝性核受體(FXR、PPARα、LXR和SREBP1c)、脂肪酸合成

3、（FAS、ACC、SCD-1等）、脂肪酸攝取（FATP4）、脂肪酸β-氧化（CPT1A）、脂聯(lián)素(Adiponectin)等基因表達(dá)。
　　結(jié)果：1.隨著棕櫚酸濃度的增加，HepG2和Hepa1-6細(xì)胞ZAG蛋白表達(dá)水平逐漸減少（P<0.01），且PA濃度為0.6mM時(shí)，其表達(dá)水平最低；此外，F(xiàn)XR蛋白表達(dá)水平也均降低，PA濃度為0.4mM時(shí)；HepG2細(xì)胞FXR蛋白表達(dá)水平明顯降低（P<0.01），PA濃度為0.6mM時(shí)，Hep

4、a1-6細(xì)胞FXR蛋白表達(dá)水平明顯降低（P<0.01）。
　　2.油紅 O染色顯示，在棕櫚酸干預(yù)下，與對(duì)照組相比較，過表達(dá)ZAG組的HepG2細(xì)胞內(nèi)橘紅色脂滴明顯減少；細(xì)胞內(nèi)甘油三酯測(cè)定顯示，與對(duì)照組相比較，過表達(dá) ZAG組的HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量減少。
　　3.與pIRES2-GFP組相比，pIRES2-hZAG組ZAG、Adiponectin、FXR、PPARα、CPT1A表達(dá)增加（p<0.05），SREBP-1c

5、、LXR、FAS、ACC、SCD-1表達(dá)降低（p<0.01），F(xiàn)ATP表達(dá)無明顯差異（p>0.05），pIRES2-GFP+PA組 ZAG、Adiponectin、FXR、PPARα表達(dá)降低（p<0.01），SREBP-1c、LXR、FAS、ACC、SCD-1、FATP、CPT1A表達(dá)增加（p<0.01）；與pIRES2-GFP+PA組相比，pIRES2-hZAG+PA組ZAG、Adiponectin、FXR、PPARα、CPT1A表達(dá)

6、增加（p<0.01），SREBP-1c、LXR、FAS、ACC、SCD-1、FATP表達(dá)降低（p<0.01）。
　　結(jié)論：1.過表 ZAG能減少棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的沉積。
　　2.過表 ZAG可通過增加代謝性核受體 FXR、PPARα的表達(dá)和降低LXR、SREBP1c的表達(dá)，使脂肪酸合成基因 FAS、SCD-1、ACC及脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因FATP4的表達(dá)降低，脂肪酸β氧化基因CPT1A的表達(dá)增加，從而減少Hep

7、G2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的沉積。
　　第二部分：
　　目的：構(gòu)建沉默ZAG的RNAi慢病毒載體，感染HepG2細(xì)胞，觀察感染病毒的HepG2細(xì)胞在棕櫚酸誘導(dǎo)下甘油三酯沉積的變化。
　　方法：1.用三條不同序列的LV-AZGP1-RNAi和LV-GFP-RNAi病毒分別感染 HepG2細(xì)胞，MOI=10，RT-qPCR篩選最佳沉默效果的LV-AZGP1-RNAi病毒。
　　2.用上述沉默效果最佳的LV-AZGP1-RNA

8、i病毒感染HepG2細(xì)胞，MOI=10，感染72小時(shí)后，用0.4mM棕櫚酸干預(yù)細(xì)胞24小時(shí)，采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的水平,油紅 O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴，Western blot在蛋白水平檢測(cè)代謝性核受體(FXR、PPARα、LXR和SREBP1c)、脂肪酸合成（FAS、ACC、SCD-1等）、脂肪酸攝取(FATP4)、脂肪酸β-氧化(CPT1A)、脂聯(lián)素(Adiponectin)等基因表達(dá)。
　　結(jié)果：1. RT-qPCR

9、結(jié)果顯示：在 HepG2細(xì)胞中，相對(duì)于LV-GFP-RNAi組，LV-AZGP1-RNAi-1組、LV-AZGP1-RNAi-2組及LV-AZGP1-RNA-3組AZGP1基因敲減效率都>70％（P<0.01），其中LV-AZGP1-RNAi-2組沉默效果最佳。
　　2.油紅O染色顯示，在棕櫚酸干預(yù)下，與對(duì)照組相比較，沉默ZAG組的HepG2細(xì)胞內(nèi)橘紅色脂滴明顯增加；細(xì)胞內(nèi)甘油三酯測(cè)定顯示，與對(duì)照組相比較，沉默 ZAG組的HepG

10、2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量增加。
　　3.與LV-GFP-RNAi組相比，LV-AZGP1-RNAi組ZAG、Adiponectin、FXR、PPARα、CPT1A表達(dá)降低（P<0.05），SREBP-1c、LXR、FAS、ACC、SCD-1表達(dá)增加（P<0.01），F(xiàn)ATP表達(dá)無明顯變化（P>0.05），LV-GFP-RNAi+ PA組ZAG、Adiponectin、FXR、PPARα表達(dá)降低（P<0.01），SREBP-1c、LXR

11、、FAS、ACC、SCD-1、FATP、CPT1A表達(dá)增加（P<0.01）；與LV-GFP-RNAi+PA組相比，LV-AZGP1-RNAi+PA組ZAG、Adiponectin、FXR、PPARα、CPT1A表達(dá)降低（P<0.01），SREBP-1c、LXR、FAS、ACC、SCD-1、FATP表達(dá)增加（P<0.01）。
　　結(jié)論：1.沉默 ZAG能增加棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的沉積。
　　2.沉默ZAG可通過