核黃素缺乏對(duì)HepG2細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜影響的研究.pdf

1、目的:建立核黃素缺乏的細(xì)胞模型，用含不同濃度核黃素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，觀測(cè)可使細(xì)胞維持正常狀態(tài)的適宜核黃素水平，用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)核黃素缺乏對(duì)HepG2蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響，進(jìn)一步分析驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果，為今后深入研究核黃素缺乏對(duì)人體影響的機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法:
　　1.胎牛血清(FBS)中核黃素的去除:無(wú)菌條件下用紫外線照射方法去除FBS中核黃素，采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定經(jīng)不同照射時(shí)間后FBS中核黃素的含量

2、，并用不同照射時(shí)間后的血清培養(yǎng)細(xì)胞，觀測(cè)細(xì)胞活力。選擇使FBS中核黃素顯著減少且可維持細(xì)胞正常狀態(tài)的紫外線照射時(shí)間，作為進(jìn)一步模型建立的前處理方法。
　　2.核黃素缺乏的模型建立與適宜干預(yù)濃度探討:通過(guò)定制無(wú)核黃素培養(yǎng)基、紫外線清除FBS中核黃素建立核黃素缺乏培養(yǎng)條件，在此基礎(chǔ)上，以不同濃度核黃素(0.76、3.76、6.76、12.76、24.76、48.76nmol/L)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞96小時(shí)，期間于不同時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)定細(xì)胞

3、活力、細(xì)胞凋亡率，于72小時(shí)測(cè)定培養(yǎng)上清液的丙二醛(MDA)含量、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性，以及細(xì)胞中谷胱甘肽還原酶(GR)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)與超氧化物歧化酶(SOD)活性，細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)與氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量。
　　3.蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)核黃素缺乏對(duì)HepG2細(xì)胞蛋白表達(dá)譜的影響:運(yùn)用非標(biāo)記(label free)定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析比較在核黃素缺乏(0.

4、76 nmol/L)和核黃素適宜(12.76nmol/L)培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天后的HepG2細(xì)胞中蛋白質(zhì)差異表達(dá)情況，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析（包括G0富集分析、KEGG通路分析，差異蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)分析），然后對(duì)篩選出的5個(gè)關(guān)鍵差異蛋白(NDUFSl，NDUFV2，SDHA，SQSTM1，ERO1A)進(jìn)行蛋白免疫印跡(Western bolt)驗(yàn)證。
　　4.核黃素缺乏對(duì)HepG2細(xì)胞載脂蛋白B100折疊及其表達(dá)通路的影響:因蛋白質(zhì)

5、組學(xué)結(jié)果顯示核黃素缺乏導(dǎo)致了可能影響載脂蛋白(Apo) B100二硫鍵折疊的關(guān)鍵蛋白(ERO1A)顯著下調(diào)，故采用酶聯(lián)免疫(ELISA)法定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外分泌ApoB100的含量，用Western bolt和逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量(RT-qPCR)技術(shù)分別檢測(cè)核黃素缺乏對(duì)ApoB100表達(dá)通路基因和蛋白的影響，隨后用Ellman法測(cè)定細(xì)胞中蛋白結(jié)合巰基以間接反映ApoB100的二硫鍵形成情況。
　　結(jié)果:
　　1.FBS中

6、的核黃素含量隨紫外線照射時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減少，F(xiàn)BS經(jīng)照射30min后核黃素含量較未照射組極顯著下降，繼續(xù)延長(zhǎng)照射時(shí)間核黃素含量下降趨勢(shì)逐漸減弱;用照射30min血清培養(yǎng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其活力與未照射組無(wú)顯著差異，而照射時(shí)間大于30min的血清組細(xì)胞活力顯著下降。
　　2.培養(yǎng)72至96小時(shí)，隨著核黃素濃度的降低，HepG2細(xì)胞活力顯著下降、細(xì)胞凋亡率顯著升高，培養(yǎng)液中AST、ALT活性顯著升高、MDA含量顯著升高，細(xì)胞內(nèi)GR活性顯著下

7、降、而GSH-Px的活性顯著上升、GSSG含量顯著上升、GSH含量顯著降低、GSH/GSSG顯著下降。上述大部分指標(biāo)的核黃素劑量效應(yīng)拐點(diǎn)在12.76nmol/L左右。證明核黃素缺乏細(xì)胞模型建立成功，維持細(xì)胞正常狀態(tài)的核黃素濃度應(yīng)高于12.76nmol/L。
　　3.本研究共鑒定到3730個(gè)蛋白質(zhì)，其中在核黃素缺乏組鑒定到2830個(gè)蛋白質(zhì)，在對(duì)照組鑒定到3020個(gè)蛋白質(zhì)，即85個(gè)蛋白是核黃素缺乏組特有、275個(gè)蛋白是對(duì)照組特有，在兩

8、組共有的2745個(gè)蛋白質(zhì)中經(jīng)差異性比較后獲得37個(gè)差異表達(dá)倍數(shù)大于2的蛋白，其中，與核黃素適宜組相比，核黃素缺乏組有13個(gè)蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，24個(gè)蛋白顯著下調(diào)。采用GO富集分析發(fā)現(xiàn)37個(gè)差異蛋白在在線粒體氧化呼吸鏈有較高富集，分子功能主要為氧化還原活性，主要參與了電子轉(zhuǎn)移，氧化還原，能量代謝等生物學(xué)過(guò)程，隨后采用KEGG信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白主要參與了18個(gè)信號(hào)通路，其中富集度較高的通路為帕金森病、脂肪酸代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等信號(hào)

9、通路。Western bolt結(jié)果顯示:與核黃素適宜組相比，核黃素缺乏組的NDUFS1、NDUFV2、SDHA、ERO1A表達(dá)顯著上調(diào)，SQSTM1表達(dá)顯著下調(diào)。驗(yàn)證結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果基本一致。
　　4.與核黃素適宜組相比，核黃素缺乏組ApoB100細(xì)胞內(nèi)含量及細(xì)胞外分泌量均顯著下降，二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)蛋白表達(dá)量顯著降低、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白(GRP78，GADD153)表達(dá)量顯著升高，細(xì)胞內(nèi)總蛋白結(jié)合巰基含量顯著下降。