棕櫚酸增加FAT-CD36表達(dá)和棕櫚?；揎椫翲epG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)異常積聚.pdf

1、目的：隨著肥胖及其相關(guān)代謝綜合征全球化的流行趨勢(shì)，非酒精性脂肪性肝?。∟on-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）在世界范圍內(nèi)成為最主要的肝臟疾病之一。脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（Fatty acid translocase， FAT/CD36）作為介導(dǎo)長(zhǎng)鏈脂肪酸細(xì)胞攝取的膜糖蛋白，在FFA的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要作用。本課題旨在觀察棕櫚酸對(duì)HepG2細(xì)胞CD36表達(dá)和翻譯后修飾的作用，并由此造成的對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)積聚產(chǎn)生的

2、影響。
　　方法：HepG2細(xì)胞用不同濃度的棕櫚酸處理。用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)CD36啟動(dòng)子活性；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time polymerase chain reaction,RT-PCR）和免疫印跡（western blot）測(cè)定CD36 mRNA和蛋白水平；多聚核糖體分析測(cè)定蛋白翻譯效率；熒光顯微鏡實(shí)時(shí)觀測(cè)細(xì)胞脂肪酸攝入；油紅O染色和游離脂肪酸（free fatty acid,FFA）測(cè)定反映胞內(nèi)脂質(zhì)含量。將N

3、C-siRNA和CD36-siRNA轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞中CD36的表達(dá)，比較CD36下調(diào)后對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚的影響。用定點(diǎn)突變的方法將野生型CD36（WT）改建為棕櫚?；揎椢稽c(diǎn)突變的CD36（AA-SS）真核表達(dá)載體，并包裝為相應(yīng)的慢病毒載體，用以感染細(xì)胞，并用嘌呤霉素篩選、建立穩(wěn)定細(xì)胞模型。用IP-ABE方法檢測(cè)細(xì)胞CD36棕櫚酰化修飾程度；用western-blot和流式細(xì)胞技術(shù)鑒定CD36在細(xì)胞的表達(dá)；進(jìn)一步提取細(xì)胞膜脂

4、筏，用western blot方法檢測(cè)CD36在細(xì)胞膜脂筏中的表達(dá)情況；用雙變量流式及實(shí)時(shí)攝像的方法動(dòng)態(tài)觀察HepG2對(duì)熒光標(biāo)記游離脂肪酸的攝取。
　　結(jié)果：棕櫚酸只在較高濃度（0.16mM、0.32mM時(shí)）增加CD36啟動(dòng)子活性（P<0.05）、mRNA（P<0.05），而在低水平（0.08mM）增加CD36蛋白表達(dá)，顯著增加CD36蛋白翻譯效率。油紅O染色發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，棕櫚酸組細(xì)胞內(nèi)脂滴增多；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)棕櫚酸組（

5、240.17±19.83ng/mg）細(xì)胞內(nèi)FFA含量較對(duì)照組（144.61±53.52ng/mg）增多（P<0.05）；熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)棕櫚酸顯著促進(jìn)了細(xì)胞對(duì)脂肪酸的攝入。CD36-siRNA組CD36 mRNA與蛋白分別為NC組的0.58±0.08（P＜0.05），0.50±0.10（P＜0.05）。CD36-siRNA組HepG2內(nèi)脂滴減少，與細(xì)胞內(nèi)FFA定量測(cè)定結(jié)果相符（ NC組240.17±21.12ng/mg，CD36 siRN

6、A組98.38±14.18ng/mg，P＜0.05），顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察也證實(shí)CD36 siRNA組細(xì)胞對(duì)脂肪酸的攝入速度明顯慢于NC組細(xì)胞。另一方面，棕櫚酸還能顯著促進(jìn)CD36的棕櫚?；揎?。慢病毒感染HepG2細(xì)胞中，超表達(dá)細(xì)胞內(nèi)CD36的蛋白表達(dá)明顯高于空載體組，并且棕櫚酰化突變組內(nèi)CD36棕櫚?；揎棾潭冉档?。流式細(xì)胞術(shù)和western blot發(fā)現(xiàn)CD36棕櫚酰化突變后對(duì)CD36在細(xì)胞的總表達(dá)無(wú)影響，但脂筏中的CD36占總CD3