炎癥干擾細(xì)胞內(nèi)膽固醇外排導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)異常積聚的分子機(jī)制.pdf

1、第一部分
　　 目的:采用皮下注射酪蛋白(Casein)誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠體內(nèi)產(chǎn)生慢性低豐度系統(tǒng)性炎癥,研究在炎癥狀態(tài)下,膽固醇代謝紊亂導(dǎo)致肝組織損害及其相關(guān)分子機(jī)制。
　　 方法:選取24只8周齡雄性C57 BL/6J小鼠,隨機(jī)分為普通飲食組(對(duì)照組,NCD)、炎癥組(NCD+Casein)、高脂組(HFD)、高脂+炎癥組(HFD+Casein),每組6只。正常飲食組給予普通飼料喂養(yǎng),高脂飲食組給予高脂飼料喂養(yǎng)(

2、含15％脂肪,1.25%膽固醇,0.5%膽酸鹽)。炎癥刺激組予隔天皮下注射0.5 ml10%酪蛋白溶液,非炎癥刺激組予隔天皮下注射0.5 ml生理鹽水,18周后處死小鼠,收集血清、肝臟、膽囊、小腸組織。采用ELISA法檢測(cè)血清中炎癥指標(biāo)白介素-6(IL-6)、血清淀粉樣蛋白(SAA)、腫瘤壞死因子僅(TNFa)的濃度。
　　 結(jié)果:與對(duì)照組相比,給予炎癥刺激的兩組小鼠血清中IL-6、SAA、TNFa的濃度水平顯著升高,差異具有統(tǒng)

3、計(jì)學(xué)意義,而單純高脂組炎癥指標(biāo)水平較對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。
　　 結(jié)論:隔日皮下注射酪蛋白18周,可誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠體內(nèi)產(chǎn)生慢性低豐度系統(tǒng)性炎癥,本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立成功。
　　 第二部分
　　 目的:觀察慢性低豐度系統(tǒng)性炎癥狀態(tài)下,C57BL/6J小鼠血清、肝臟、膽囊、小腸及HepG2細(xì)胞中脂質(zhì)含量水平及膽固醇外排相關(guān)指標(biāo)的變化情況,探討炎癥是否加重脂質(zhì)誘導(dǎo)的肝損害。
　　 方法:將HepG2細(xì)胞

4、分為以下4組:對(duì)照組(Control)、炎癥組(TNFα)、高脂組(LDL)、高脂+炎癥組(LDL+ TNFα,)。用HE染色及油紅O染色觀察小鼠肝臟及HepG2細(xì)胞形態(tài)及脂質(zhì)沉積情況。用化學(xué)酶促.比色法測(cè)定小鼠肝臟及HepG2細(xì)胞內(nèi)總膽固醇(TC)、游離膽固醇(FC)、膽固醇酯(CE)的含量。用酶法測(cè)定小鼠血清TC、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)水平。用3[H]標(biāo)記膽固醇-液體閃爍計(jì)數(shù)法檢測(cè)HepG2細(xì)胞膽固醇外流量。

5、用磷鉬酸比色法檢測(cè)小鼠肝臟、膽囊及近端小腸中膽汁酸水平。
　　 結(jié)果:肝組織HE染色顯示,與對(duì)照組相比,炎癥組與高脂組的肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂,肝細(xì)胞內(nèi)有明顯脂滴積聚和少量空泡形成,而高脂+炎癥組可見(jiàn)肝細(xì)胞大量空泡樣變性及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。肝組織和HepG2細(xì)胞油紅O染色顯示,與對(duì)照組相比其余三組紅染顆粒增多,且以高脂+炎癥組最為明顯。肝組織和HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比其余三組TC、FC、CE含量均增加,且以高脂+炎

6、癥組最為顯著(P＜0.05)。小鼠血清TC、LDL、HDL檢測(cè)結(jié)果顯示,高脂飲食增加了小鼠血清中三者的濃度,而無(wú)論給予正常飲食或高脂飲食,炎癥刺激均能降低三者血清中的濃度(P＜0,05)。細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流測(cè)定結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,高脂組膽固醇外流量增加而炎癥組降低,高脂+炎癥組較高脂組外流量明顯減少(P＜0.05)。小鼠總膽汁酸水平檢測(cè)結(jié)果顯示,高脂組肝臟、膽囊及近端小腸中總膽汁酸水平較對(duì)照組增高,而高脂+炎癥組與單純高脂組相比,其水

7、平降低(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:慢性低豐度系統(tǒng)性炎癥可引起C57BL/6J小鼠肝臟及HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)異常積聚,干擾了膽固醇外流及膽汁酸合成過(guò)程。
　　 第三部分
　　 目的:探討炎癥通過(guò)干擾過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體(PPAR)、肝X受體α(LXRα,)、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ABCA1)、膽固醇7α,羥化酶1(CYP7A1)介導(dǎo)的膽固醇外排致肝內(nèi)脂質(zhì)積聚的分子機(jī)制。
　　 方法:在前面兩

8、個(gè)部分所建立的小鼠及細(xì)胞模型上,采用實(shí)時(shí)定量PCR(Real-Time PCR)法和蛋白免疫印跡(Western Blotting)法分別檢測(cè)小鼠肝臟和HepG2細(xì)胞中PPARα、PPARy、LXRα,、ABCA1、CYP7A1等基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:Real-Time PCR結(jié)果表明,無(wú)論在小鼠肝臟或HepG2細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,高脂組中PPARα、PPARy、LXRα、ABCA1、CYP7A1的mRN