CD36棕櫚酰化修飾在肝細(xì)胞凋亡中的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）已經(jīng)成為嚴(yán)重影響人類健康的常見病，有1/3的病人會發(fā)展為相對兇險(xiǎn)的非酒精性脂肪性肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis，NASH），但其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚且缺乏有效的臨床治療。大量的臨床數(shù)據(jù)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，肝細(xì)胞凋亡可以進(jìn)一步促進(jìn)炎癥、纖維化、硬化等反應(yīng)，在NASH

2、發(fā)生中有重要作用。CD36又稱為脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（Fatty acid translocase，F(xiàn)AT）是清道夫受體B型成員，CD36缺失或者過表達(dá)都會引發(fā)NASH。棕櫚?；揎検堑鞍追g后修飾的一種，有研究報(bào)道蛋白的棕櫚酰化修飾會影響細(xì)胞凋亡。CD36也可進(jìn)行棕櫚?；揎棧欢鳦D36棕櫚?；c細(xì)胞凋亡的關(guān)系卻無人報(bào)道。因此本文旨在探討CD36棕櫚酰化修飾是否參與了肝細(xì)胞凋亡導(dǎo)致NASH的發(fā)生，并對其中機(jī)制作初步探討。
　　方法:第

3、一部分：以C57BL/6J雄性小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，給予正常飲食（Nornal chow diet，NCD）和高脂飲食（High fat diet，HFD）喂養(yǎng)22周，建立NASH動(dòng)物模型。HE染色觀察形態(tài)學(xué)，油紅O染色觀察脂質(zhì)積聚情況，檢測小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase， ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspertate Aminotransferase，AST）含量。體外模型中，HepG2給予棕櫚酸（Pal

4、mitate acid，PA）處理，油紅O觀察脂質(zhì)積聚情況。在體內(nèi)外模型中，用?；?生物素置換法（Acyl-Biotinyl exchange，ABE）方法檢測CD36棕櫚?；揎椝?。Western blot用來檢測腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor， TNF-α）的表達(dá)和Jun N-terminal kinase（JNK）的磷酸化，用TUNEL染色和Caspase-3活性檢測細(xì)胞凋亡，適時(shí)熒光定量PCR（RT-

5、PCR）檢測凋亡基因Bax，Bcl-2的表達(dá)。第二部分：選擇C57BL/6J小鼠，通過尾靜脈注射慢病毒，使小鼠高表達(dá)野生型CD36（wt-CD36）或棕櫚酰化位點(diǎn)突變型CD36（AA-SS），并全程給予高脂喂養(yǎng)8周，構(gòu)建體內(nèi)模型。在HepG2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染慢病毒，使HepG2穩(wěn)定高表達(dá)野生型CD36（wt-CD36）或棕櫚?；稽c(diǎn)突變型CD36（AA-SS），建立穩(wěn)定細(xì)胞系。另采用蛋白棕櫚?；种苿?-溴軟脂酸乙烯（2-Bromopalm

6、itate，2-BP）處理HepG2完成體外實(shí)驗(yàn)。用ABE方法檢測CD36棕櫚?；揎椝?；進(jìn)行HE、油紅O染色和小鼠血清中ALT和AST含量測定；用TUNEL染色及Caspase-3檢測反應(yīng)凋亡情況；用RT-PCR檢測凋亡基因Bax、Bcl-2的表達(dá)。第三部分：利用第二部分的動(dòng)物和細(xì)胞模型，用Western blot檢測體內(nèi)外TNF-α表達(dá)及JNK磷酸化水平；利用免疫共沉淀的方法檢測CD36和 TLR4共聚體的形成；用去垢劑抵抗（ D

7、etergent-resistant membranes，DRMs）的方法分離提取脂筏，并觀察CD36在脂筏的分布。
　　結(jié)果：第一部分：HE和油紅O染色發(fā)現(xiàn)HFD小鼠肝臟脂肪樣變性、脂質(zhì)積聚和炎癥細(xì)胞浸潤明顯高于NCD小鼠，而且Western blot顯示TNF-α表達(dá)和JNK信號通路磷酸化水平增加同時(shí)伴有CD36棕櫚?；皆黾樱琓UNEL陽性細(xì)胞增多，Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)下降， Caspase-3活性增加，血清中A

8、LT和AST明顯增加（P<0.05），HFD小鼠肝臟明顯受損，小鼠肝臟CD36棕櫚?；矫黠@增加（P<0.05）。第二部分：HE和油紅O染色提示AA-SS小鼠肝臟病變較wt-CD36有所減輕，血清中ALT和AST水平下降，TUNEL陽性細(xì)胞減少，Caspase-3活性降低，Bcl-2表達(dá)明顯增加。體外實(shí)驗(yàn)采用突變或抑制劑處理都可以降低CD36棕櫚酰化修飾水平，降低凋亡caspase-3活性，促進(jìn)Bcl-2表達(dá)增加（P<0.05）。第三

9、部分：Western blot、免疫共沉淀和脂筏的結(jié)果顯示，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，采用突變（AA-SS）或者抑制劑（2BP）處理均可降低TNF-α表達(dá)及JNK磷酸化水平，且CD36和TLR4形成共聚體減少，CD36在脂筏的分布比例降低，與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：1.高脂飲食可以導(dǎo)致NASH的發(fā)生，增加小鼠肝細(xì)胞凋亡及CD36棕櫚?；揎椝?；2.抑制CD36棕櫚?；軌驕p少CD36在脂筏中的分布，與TLR4形成