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文檔簡介
1、目的:構(gòu)建重組人ZAG(Zinc-α2 glycoprotein)真核表達(dá)載體,并瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,觀察HepG2細(xì)胞過表達(dá)ZAG后對棕櫚酸誘導(dǎo)的甘油三酯沉積的影響。
方法:提取HepG2細(xì)胞總RNA,通過RT-PCR方法擴增出ZAG序列,克隆入經(jīng) XhoI和 SacII雙酶切后的pIRES2-ZsGreen1,重組人 ZAG真核表達(dá)質(zhì)粒(pIRES2-ZsGreen1-hZAG)通過核苷酸測序鑒定。使用不同濃度pIRE
2、S2-ZsGreen1-hZAG的經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞24小時,western-blotting鑒定ZAG陽性細(xì)胞,并采用棕櫚酸誘導(dǎo)該細(xì)胞脂肪變性,采用油紅O染色觀察各組細(xì)胞內(nèi)脂滴情況,酶聯(lián)免疫法檢測細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的水平。
結(jié)果:1.成功構(gòu)建人ZAG基因的真核表達(dá)載體pIRES2-ZsGreen1-hZAG,該載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后,能顯著增加ZAG蛋白的表達(dá)。
2.與對照組相比,過表達(dá)ZAG的HepG2細(xì)胞
3、能減少棕櫚酸誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量;油紅O染色結(jié)果顯示過表達(dá)ZAG的HepG2細(xì)胞在棕櫚酸誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)橘紅色脂滴較對照組HepG2細(xì)胞明顯減少。
結(jié)論:1.構(gòu)建了ZAG基因的真核表達(dá)載體pIRES2-ZsGreen1-hZAG,并成功轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞。
2.過表達(dá)ZAG能減少棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞甘油三酯的沉積。
目的:探討ZAG降低棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2內(nèi)甘油三酯沉積機制。
方法:體外培
4、養(yǎng)HepG2細(xì)胞和建立ZAG瞬時過表達(dá)HepG2細(xì)胞,分別加入或不加入棕櫚酸干預(yù),應(yīng)用Western blotting在蛋白水平檢測代謝性核受體(SREBP1c、PPARα、LXRα和FXR)、脂肪酸合成(ACC、FAS)、脂肪酸β-氧化基因表達(dá)。
結(jié)果:1.與對照組相比,棕櫚酸干預(yù)組SREBP-1c、LXRα、ACC、FAS的表達(dá)增加,F(xiàn)XR、PPARα的表達(dá)降低。
2.與空白載體組相比,過表達(dá) ZAG組 FXR和
5、 CPT1A表達(dá)增加,而SREBP-1c表達(dá)下降。
3.在棕櫚酸干預(yù)下,過表達(dá)ZAG組較空白載體組FXR、PPARα、CPT1表達(dá)增加,SREBP-1c、LXRα、ACC、FAS表達(dá)減少。
結(jié)論:1.棕櫚酸能通過增加SREBP-1c、LXRα、ACC、FAS的表達(dá),降低PPARα、FXR的表達(dá)促進HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的沉積。
2.過表達(dá)ZAG能增加FXR和CPT1A的表達(dá),降低SREBP-1c的表達(dá)。<
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