落新婦三萜酸A對(duì)HepG2細(xì)胞的抗腫瘤作用研究.pdf

1、落新婦為虎耳草科植物落新婦Astilbe chinese(Maxim.) Franch.et Sav.的根莖，為較常用的草藥，廣泛分布于我國(guó)南北各地區(qū)，資源十分豐富。民間俗稱“黑芨”，用以治療各種惡性腫瘤。本實(shí)驗(yàn)室以體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)為導(dǎo)向，從落新婦根莖中定向追蹤篩選分離得到5個(gè)具有顯著抗腫瘤活性的五環(huán)三萜類(lèi)化合物，分別命名為ATA、ATB、ATC、ATD和ATE，其中以ATA活性最顯著。本課題研究發(fā)現(xiàn)，與人宮頸癌HeLa細(xì)胞和人結(jié)直腸癌C

2、OLO205細(xì)胞相比，ATA對(duì)HepG2細(xì)胞更為敏感。目前，對(duì)天然藥物抗腫瘤的研究，已邁入分子生物學(xué)的研究時(shí)代，分子水平研究成果正逐漸揭開(kāi)天然藥物抗腫瘤作用的神秘面紗，不僅為臨床應(yīng)用抗腫瘤中藥提供充分的理論依據(jù)，而且為天然藥物抗腫瘤指明了研究的方向。本課題為了深入地探討ATA的抗腫瘤作用途徑，選取HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，先從誘導(dǎo)凋亡和阻滯細(xì)胞周期方面，分析ATA對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用。隨后，采用美國(guó)SA Biosciences公司

3、新一代功能性基因芯片Human Cancer Pathway Finder PCRArray，從基因水平上全面地分析ATA作用HepG2細(xì)胞的顯著差異表達(dá)基因，并采用RT-PCR對(duì)PCR芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)，根據(jù)PCR芯片結(jié)果，進(jìn)一步進(jìn)行了ATA抗黏附、抗侵襲和抗轉(zhuǎn)移作用研究，并結(jié)合PCR芯片結(jié)果，深入地討論ATA的抗腫瘤作用途徑。
　　 1.ATA對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響
　　 采用MTT法測(cè)定了ATA對(duì)

4、人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用。結(jié)果顯示，ATA能顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖，并呈濃度和時(shí)間依賴性關(guān)系。
　　 細(xì)胞凋亡具有一系列典型的形態(tài)學(xué)特征和生化特征。本實(shí)驗(yàn)采用吖啶橙AO和JC-1染色，熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀分析了ATA對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)和線粒體跨膜電位的影響。結(jié)果表明:HepG2細(xì)胞經(jīng)ATA處理后，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)致密的黃綠色熒光，甚至可見(jiàn)濃染的黃綠色熒光，并出現(xiàn)凋亡小體和空泡，呈典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化;

5、ATA能顯著地降低HepG2細(xì)胞的線粒體跨膜電位，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增加，作用逐漸增強(qiáng)呈。線粒體跨膜電位的降低是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。因此，這些結(jié)果表明:ATA可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。
　　 為了進(jìn)一步探討ATA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，采用RT-PCR法分析凋亡相關(guān)基因的mRNA表達(dá)變化。結(jié)果表明:ATA能顯著上調(diào)HepG2細(xì)胞Caspase-8、Fas和Caspase-9、bak、bax和bad的基因

6、表達(dá)，下調(diào)Bcl-w的mRNA表達(dá)。可見(jiàn)，ATA可通過(guò)死亡受體通路和線粒體通路共同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 細(xì)胞凋亡常伴隨有細(xì)胞周期的阻滯。流式細(xì)胞儀測(cè)定ATA處理HepG2細(xì)胞周期分布，并采用RT-PCR法分析細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)變化。結(jié)果表明，ATA可上調(diào)p53和p21基因表達(dá)，通過(guò)p53介導(dǎo)途徑，阻滯HepG2細(xì)胞于G2期。
　　 2.ATA作用HepG2細(xì)胞的顯著差異表達(dá)基因
　　 為了全面深入地探討ATA的

7、抗腫瘤作用途徑，采用Cancer Pathway Finder PCR芯片檢測(cè)ATA對(duì)HepG2細(xì)胞基因表達(dá)的影響，并采用RT-PCR方法對(duì)7個(gè)顯著差異表達(dá)基因（含4個(gè)上調(diào)基因和3個(gè)下調(diào)基因）進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)了PCR芯片結(jié)果的可信性。
　　 PCR芯片結(jié)果顯示:HepG2細(xì)胞經(jīng)ATA處理后，涉及腫瘤發(fā)生和發(fā)展六條生物學(xué)通路代表性84個(gè)功能性基因中，約20個(gè)基因表達(dá)水平發(fā)生了顯著的變化，其中9個(gè)基因表達(dá)顯著性上調(diào)，11個(gè)基因表達(dá)下調(diào)

8、。這些基因涉及細(xì)胞的凋亡、周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄因子、血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移等通路。其中，細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)的顯著差異表達(dá)基因約占顯著差異表達(dá)基因總數(shù)的35％，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄因子約占12％，其余53％涉及侵襲轉(zhuǎn)移及血管生成。細(xì)胞凋亡及周期相關(guān)的基因的表達(dá)變化，生物信息學(xué)分析結(jié)果表明:ATA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期的作用，可能通過(guò)MAPK和Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路?？v觀所有顯著差異表達(dá)基因，侵襲轉(zhuǎn)移及血管生成相關(guān)基因所占的比例最大，而且上

9、調(diào)或下調(diào)差異最顯著的基因，也多為侵襲轉(zhuǎn)移及血管生成相關(guān)基因以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和轉(zhuǎn)錄因子。這提示我們，與影響細(xì)胞凋亡和周期途徑相比，ATA對(duì)HepG2細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移及血管生成途徑的影響似乎更為顯著。
　　 3.ATA對(duì)HepG2細(xì)胞黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移力的影響
　　 局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最主要的生物學(xué)特性，是臨床治療失敗和影響預(yù)后的最主要因素。PCR芯片結(jié)果顯示，ATA對(duì)HepG2細(xì)胞的抗腫瘤作用，與其抑制細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移

10、及血管生成有緊密聯(lián)系。因此，采用黏附試驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕損傷實(shí)驗(yàn)，分別測(cè)定ATA對(duì)HepG2細(xì)胞的黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果表明，ATA可顯著降低HepG2細(xì)胞黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。
　　 結(jié)合PCR芯片結(jié)果可知，ATA能下調(diào)HepG2細(xì)胞外基質(zhì)降解酶MMP-9、uPA、以及促血管生成因子ANGPT1、TEK和TGFBR1等基因的表達(dá)，上調(diào)抑血管因子THBS1基因的表達(dá);同時(shí)，ATA處理的HepG2細(xì)胞免疫