落新婦抗腫瘤活性成分對(duì)腫瘤細(xì)胞免疫抑制的逆轉(zhuǎn)作用研究.pdf

1、免疫逃逸(immune escape)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中有著重要的作用，其機(jī)制復(fù)雜，涉及腫瘤和宿主兩方面。從腫瘤角度來說，一方面，腫瘤抗原的缺失、MHC分子的改變、共刺激分子的缺乏等都可以使腫瘤免受宿主免疫細(xì)胞的識(shí)別，從而逃脫抗腫瘤免疫反應(yīng);另一方面，腫瘤也可以通過“Fas反擊機(jī)制”、免疫抑制性分子的分泌等機(jī)制主動(dòng)影響抗腫瘤免疫細(xì)胞的增殖活化和功能。3β-羥基齊墩果-12-烯-27-羧酸(3β-hydroxyolean-12-en

2、-27-oic acid，ATA)、3β,6β-二羥基齊墩果-12-烯-27-羧酸(3β,6β-dihydroxyolean-12-en-27-oic acid，ATB)和3β-羥基烏蘇-12-烯-27-羧酸(3β-hydroxyur-12-en-27-oic acid，ATC)系虎耳草科Saxifragaceae植物落新婦Astilbechinese(Maxim.)Franch.et Say.的干燥根莖中分離得到的抗腫瘤活性三萜化合物

3、，能顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，同時(shí)具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，而其在腫瘤免疫逃逸機(jī)制方面的研究尚未見報(bào)道。本研究選擇具有免疫抑制作用的人紅白血病K562細(xì)胞和小鼠成纖維瘤L929細(xì)胞，通過檢測(cè)3個(gè)化合物處理前后腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫功能的影響及其免疫抑制分子mRNA表達(dá)的變化，從逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫抑制的角度探討這些化合物的抗腫瘤免疫作用機(jī)制。
　　 1.K562和L929細(xì)胞的免疫抑制作用研究
　　 MTT法測(cè)定K562

4、和L929細(xì)胞不同培養(yǎng)時(shí)間的培養(yǎng)上清對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)和自然殺傷(NK)細(xì)胞殺傷活性的影響。結(jié)果表明: K562和L929細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間的培養(yǎng)上清對(duì)Con A和LPS誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)，以及NK細(xì)胞殺傷活性均呈抑制作用，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率逐漸升高，證實(shí)K562和L929細(xì)胞培養(yǎng)上清具有免疫抑制作用。
　　 2.ATA、ATB和ATC對(duì)K562和L929腫瘤細(xì)胞免疫抑制作用的影響
　　 MTT法檢測(cè)AT

5、A、ATB和ATC處理K562和L929腫瘤細(xì)胞再培養(yǎng)上清對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)和NK細(xì)胞殺傷活性影響。結(jié)果顯示:ATA、ATB和ATC處理K562和L929細(xì)胞再培養(yǎng)上清對(duì)Con A和LPS誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖反應(yīng)以及NK細(xì)胞殺傷活性的抑制作用均顯著低于單純K562和L929細(xì)胞培養(yǎng)上清，說明ATA、ATB和ATC可逆轉(zhuǎn)K562和L929細(xì)胞對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)和NK殺傷活性的抑制作用。
　　 3.ATA、ATB和ATC對(duì)K562和

6、L929細(xì)胞TGF-β1和VEGF基因表達(dá)的影響
　　 K562和L929細(xì)胞經(jīng)ATA、ATB和ATC作用48小時(shí)后，其轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelialgrowth factor，VEGF)mRNA表達(dá)水平均顯著低于未處理的對(duì)照細(xì)胞。表明ATA、ATB、ATC能下調(diào)K562和L929細(xì)胞TGF-β1和VEGF

7、mRNA表達(dá)。
　　 4.ATA、ATB和ATC處理K562和L929細(xì)胞對(duì)小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響
　　 采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測(cè)定ATA、ATB和ATC處理K562和L929細(xì)胞再培養(yǎng)上清對(duì)小鼠脾細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-4(Interleukin-4，IL-4)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、γ干擾(Interferon-γ，IFN-γ)能力的影響。結(jié)果顯

8、示:小鼠脾細(xì)胞與K562和L929細(xì)胞培養(yǎng)上清共孵育48h后，其上清中TNF-a和IFN-γ含量顯著降低，而IL-4水平顯著提高，說明K562和L929細(xì)胞能抑制Th1型細(xì)胞因子產(chǎn)生，促進(jìn)Th2型細(xì)胞因子分泌。K562和L929細(xì)胞經(jīng)ATA、ATB和ATC處理后，其再培養(yǎng)上清對(duì)小鼠脾細(xì)胞分泌TNF-a和IFN-γ的抑制作用，以及對(duì)IL-4產(chǎn)生的促進(jìn)作用均較單純K562和L929培養(yǎng)上清降低。說明ATA、ATB和ATC均能逆轉(zhuǎn)K562和L

9、929細(xì)胞促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞分泌Th2型細(xì)胞因子，以及抑制分泌Th1型細(xì)胞因子的作用。
　　 5.ATA、ATB和ATC處理K562和L929細(xì)胞對(duì)小鼠脾細(xì)胞細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響
　　 采用RT-PCR方法檢測(cè)經(jīng)3種化合物作用后的K562和L929細(xì)胞再培養(yǎng)上清對(duì)小鼠脾細(xì)胞細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明:與單純腫瘤培養(yǎng)上清對(duì)照比較，ATA、ATB和ATC處理K562和L929細(xì)胞再培養(yǎng)上清均能促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞IFN-γ、T

10、NF-α和IL-2 mRNA表達(dá)，ATB和ATC處理K562和L929細(xì)胞再培養(yǎng)上清則能顯著抑制小鼠脾細(xì)胞IL-10 mRNA表達(dá)。同時(shí)，ATA處理L929細(xì)胞再培養(yǎng)上清刺激的小鼠脾細(xì)胞IL-10 mRNA表達(dá)水平也顯著低于單純L929培養(yǎng)上清，而ATA處理K562腫瘤細(xì)胞再培養(yǎng)上清共孵育小鼠脾細(xì)胞IL-10 mRNA表達(dá)水平則顯著高亍單純K562培養(yǎng)上清。說明ATA、ATB和ATC均能拮抗K562和L929細(xì)胞對(duì)小鼠脾細(xì)胞Th1型細(xì)胞