鋅alpha-2糖蛋白調(diào)控脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油三酯代謝的研究.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建小鼠鋅α2糖蛋白(Zinc-α2-glycoprotein)的重組真核表達(dá)載體，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染3T3-L1前脂肪細(xì)胞，研究鋅α2糖蛋白(ZAG)調(diào)控脂肪細(xì)胞甘油三酯(ATG)代謝的作用及機(jī)制。
　　方法：
　　1、提取正常小鼠肝組織總的RNA，通過RT-PCR法擴(kuò)增mZAG全基因表達(dá)序列，雙酶切表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)，將擴(kuò)增后的mZAG全基因表達(dá)序列插入空質(zhì)粒中，從而構(gòu)建pcDNA3.1(-)-mZ

2、AG真核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)PCR擴(kuò)增方法和核苷酸測序驗(yàn)證后通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將pcDNA3.1(-)-mZAG序列轉(zhuǎn)染至3T3-L1前脂肪細(xì)胞中，G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，Western Blot檢測mZAG表達(dá)情況并檢測激素敏感脂肪酶(HSL)、脂肪甘油三脂水解酶(ATGL)蛋白表達(dá)，RT-PCR檢測HSL、ATGL mRNA表達(dá)，ELISA法測定脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液上清中游離脂肪酸(FFA)濃度。
　　2、體外培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞，用

3、含有胰島素、IBMX與地塞米松的分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化細(xì)胞，予以重組 ZAG蛋白(20μg/mL)干預(yù)。采用油紅 O染色觀察脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴聚集、透射電鏡掃描觀察脂肪細(xì)胞線粒體數(shù)目變化及ELISA法測定脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液上清中FFA濃度。
　　結(jié)果：
　　1、mZAG真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-mZAG經(jīng)測序鑒定證實(shí)成功構(gòu)建。
　　2、過表達(dá)ZAG組的HSL、ATGL mRNA和蛋白表達(dá)水平高于未轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(

4、P<0.05)。
　　3、過表達(dá)ZAG組的細(xì)胞培養(yǎng)液上清中FFA水平與未轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　4、重組ZAG蛋白干預(yù)分化成熟的脂肪細(xì)胞48h，細(xì)胞培養(yǎng)液上清中FFA濃度低于對照組，差異有顯著性(P<0.05)。脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量少、體積小，線粒體數(shù)量增多。
　　結(jié)論：
　　1、成功構(gòu)建mZAG真核表達(dá)載體，建立ZAG穩(wěn)定表達(dá)3T3-L1細(xì)胞系。
　　2、ZAG過表達(dá)可上調(diào)