Kufor-Rakeb綜合征相關(guān)蛋白ATP13A2與細(xì)胞內(nèi)錳代謝.pdf

1、目的:
　　Kufor-Rakeb綜合征與ATP13A2的突變有關(guān),并且,各種類型的帕金森綜合癥病人中也發(fā)現(xiàn)了ATP13A2突變。經(jīng)預(yù)測ATP13A2可能是一個溶酶體P5型ATPase,在調(diào)節(jié)陽離子代謝中起重要作用。而大腦中的陽離子代謝紊亂參與了帕金森病的病理進(jìn)程,但是其確切的機(jī)制不明。對ATP13A2的生物學(xué)功能和突變的病理性機(jī)制的研究將有助于提高我們對帕金森病發(fā)病機(jī)制的理解。
　　方法:
　　1、在HEK293,N

2、2a細(xì)胞以及體外培養(yǎng)的神經(jīng)元中過表達(dá)ATP13A2野生型和KRS相關(guān)突變體,通過與溶酶體,線粒體,高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志蛋白的免疫熒光染色,對ATP13A2野生型和KRS相關(guān)突變體進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究。同時,使用ATP13A2抗體在SH-SY5Y細(xì)胞中確定內(nèi)源性ATP13A2的亞細(xì)胞定位。
　　2、利用蛋白酶體抑制劑(MG132),溶酶體和自噬抑制劑(NH4CL,3-MA)來阻斷ATP13A2可能的降解途徑,通過免疫印跡來確定ATP1

3、3A2WT以及KRS相關(guān)突變體在細(xì)胞內(nèi)的降解途徑。
　　3、利用CHX抑制蛋白合成,在不同時間點(diǎn)收集細(xì)胞樣品,通過免疫印跡來確定ATP13A2野生型以及KRS相關(guān)突變體的半衰期。
　　4、為研究ATP13A2對α-synuclein的作用,首先在穩(wěn)定表達(dá)ATP13A2野生型以及KRS相關(guān)突變體的N2a細(xì)胞中過表達(dá)α-synuclein,免疫印跡檢測ATP13A2是否能影響Triton X-100可溶性和不可溶性α-synuc

4、lein的含量;其次,共轉(zhuǎn)染ATP13A2和α-synuclein并使用MnCl2處理,檢測ATP13A2對α-synuclein表達(dá)量的影響;再次,在SH-SY5Y細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ATP13A2,檢測ATP13A2對內(nèi)源性α-synuclein的影響。
　　5、使用不同濃度不同種類的重金屬離子(MnCl2,NiCl2或FeCl2)處理穩(wěn)定表達(dá)ATP13A2野生型和KRS相關(guān)突變體的細(xì)胞,觀察細(xì)胞形態(tài)變化,通過PI或者DAPI染色來計數(shù)

5、凋亡細(xì)胞數(shù)目并檢測胞漿細(xì)胞色素c的釋放。使用石墨爐原子吸收光譜法檢測穩(wěn)定表達(dá).ATP13A2野生型和KRS相關(guān)突變體細(xì)胞內(nèi)Mn2+的含量。同時,檢測在Mn誘導(dǎo)下內(nèi)源性ATP13A2的表達(dá)改變情況。
　　6、利用基因表達(dá)芯片技術(shù),分析穩(wěn)定表達(dá)ATP13A2野生型以及KRS相關(guān)突變體細(xì)胞系全基因組mRNA表達(dá)水平的改變。使用生物信息學(xué)方法分析ATP13A2可能影響的蛋白和信號通路。
　　結(jié)果:
　　1、ATP13A2野生型

6、為溶酶體膜蛋白;
　　2、ATP13A2 KRS相關(guān)突變體異常聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng);
　　3、ATP13A2 KRS相關(guān)突變體主要通過蛋白酶體途徑降解;
　　4、ATP13A2 KRS相關(guān)突變體半衰期較野生型蛋白明顯縮短;
　　5、ATP13A2對Triton X-100可溶性和不可溶性α-synuclein沒有影響。使用MnCl2或沒有MnCl2處理,都沒有觀察到α-synuclein表達(dá)量的改變。同時ATP13A2對

7、內(nèi)源性α-synuclein表達(dá)量也沒有明顯影響;
　　6、ATP13A2WT細(xì)胞能特異性抵抗Mn2+導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡,而KRS相關(guān)突變體幾乎沒有保護(hù)作用;
　　7、ATP13A2WT能降低細(xì)胞內(nèi)Mn2+的含量,從而減少M(fèi)n2+引起的細(xì)胞色素c的釋放,抑制細(xì)胞死亡;
　　8、Mn誘導(dǎo)內(nèi)源性ATP13A2表達(dá)量增加;
　　9、ATP13A2 KRS相關(guān)突變體可能影響金屬結(jié)合蛋白相關(guān)基因和MAPK信號通路;
　　

8、10、ATP13A2過表達(dá)可能影響L-DOPA轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因和膜泡(vesicle)運(yùn)輸和胞吐相關(guān)基因;
　　結(jié)論:
　　1、野生型ATP13A2是一種溶酶體膜蛋白。KRS突變導(dǎo)致ATP13A2聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng),并快速被蛋白酶體途徑降解。
　　2、ATP13A2抵抗僅α-synuclein引起細(xì)胞毒性作用,可能并不是通過降低α-synuclein的表達(dá)量介導(dǎo)。
　　3、ATP13A2WT能影響Mn的代謝,從而特異性抵抗