亞硫酸鈉對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量和ARF-1、COPⅠ表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　 前期的體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)亞硫酸鹽可引起肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的脂滴沉積，本次實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察亞硫酸鹽染毒后肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量變化情況和極低密度脂蛋白(VLDL)分泌外排的關(guān)鍵蛋白分子改變情況，以探討亞硫酸鹽的肝損傷可能途徑。
　　 方法：
　　 將人肝癌細(xì)胞株(HepG2)培養(yǎng)于含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用0.25％胰蛋白酶溶液消化，將細(xì)胞調(diào)成一定密度的單細(xì)胞懸液，接種

2、于培養(yǎng)板中。細(xì)胞融合至一定程度后，用不同濃度的亞硫酸鈉(Na2SO3)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染毒，其終濃度為0、0.039、0.156、0.625、2.5、10mmol/L，并以四氯化碳(CCL4)染毒組作為Na2SO3的陽(yáng)性對(duì)照，以完全培養(yǎng)基組作為陰性對(duì)照。采用乳酸脫氫酶(LDH)活力測(cè)定法檢測(cè)肝細(xì)胞膜的通透性變化；采用CCK-8法檢測(cè)肝細(xì)胞的活性改變；采用油紅O染色法觀察肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積情況，采用酶化學(xué)法檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)含量；采用相

3、應(yīng)抗體進(jìn)行蛋白印跡(westernblot)分析分別檢測(cè)ARF-1、COPI等蛋白表達(dá)水平；采用熒光定量PCR法檢測(cè)ARF-1、COPI、APOE等基因的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1、LDH活性檢測(cè)分析顯示：染毒24h后10mmol/LNa2SO3可使肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH活性增加(p＜0.05)，釋放率升高，與陰性對(duì)照組相比有顯著性差異，其余各染毒組與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。染毒48h和72h后各染毒組培養(yǎng)上清中

4、LDH的活性與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。
　　 2、CCK-8試驗(yàn)顯示：處理24h、48h后各組HepG2細(xì)胞的存活率隨Na2SO3劑量的增加而降低，與培養(yǎng)基對(duì)照組相比有顯著性差異(p＜0.05);染毒72h后，除0.039mmol/L組外，其他組細(xì)胞的存活率與培養(yǎng)基對(duì)照組相比均有顯著性差異(p＜0.05）。
　　 3、油紅O染色法觀察發(fā)現(xiàn)，染毒24h～48h后部分染毒組細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了極少量的脂滴，而陰性對(duì)照組卻沒(méi)有。染毒7

5、2h后10mmol/L的Na2SO3處理組出現(xiàn)明顯脂滴。
　　 4、酶化學(xué)法檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)TG試驗(yàn)顯示：染毒24h后，2.5mmol/LNa2SO3和1mmol/L油酸可使肝細(xì)胞內(nèi)TG含量明顯增高，與對(duì)照組相比有明顯差異(p＜0.05）；染毒48h后，10mmol/LNa2SO3和1mmol/L油酸染毒組TG含量顯著增高(p＜0.05），分別為對(duì)照組的62.71倍和7.47倍；染毒72h后，2.5mmol/L、10mmol/LNa

6、2SO3染毒組和1mmol/L油酸組與對(duì)照組相比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05）。
　　 5、Westernblot實(shí)驗(yàn)顯示Na2SO3染毒作用24h后，ARF-1和COPI蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化；染毒作用48h和72h后肝細(xì)胞內(nèi)ARF-1和COPI蛋白表達(dá)有隨染毒劑量的增加而增加的趨勢(shì)，其中2.5mmol/L、10mmol/L亞硫酸鈉染毒組ARF-1和COPI蛋白表達(dá)明顯增加。
　　 6、亞硫酸鈉染毒作用24h后，各劑量

7、組HepG2細(xì)胞內(nèi)ARF-1基因表達(dá)水平明顯降低，0.039mmol/L，2.5mmol/L及10mmol/L染毒組細(xì)胞內(nèi)COPI基因表達(dá)水平，及0.156mmol/L和2.5mmol/LNa2SO3組細(xì)胞內(nèi)APOE基因的表達(dá)水平明顯降低，與陰性對(duì)照組相比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；染毒作用48h后，僅0.039mmol/L亞硫酸鈉作用組細(xì)胞內(nèi)APOE基因表達(dá)水平低于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；染毒作用72h后，0.

8、039mmol/L亞硫酸鈉作用組細(xì)胞內(nèi)APOE基因表達(dá)水平仍低于陰性對(duì)照組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、Na2SO3對(duì)肝細(xì)胞活性有明顯的抑制作用，且呈一定的劑量—反應(yīng)關(guān)系。
　　 2、高濃度Na2SO3染毒可增加肝細(xì)胞膜的通透性，并且引起肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯蓄積。
　　 3、Na2SO3染毒可增加肝細(xì)胞內(nèi)ARF-1和COPI蛋白表達(dá)。
　　 4、Na2SO3對(duì)肝細(xì)胞ARF-1、COPI和