食品添加劑亞硫酸鈉的肝損傷機制研究.pdf

1、目的： 文獻報道和前期體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)亞硫酸鹽可能引起肝細胞脂肪變性和甘油三酯含量增加,本次試驗擬通過體外實驗證實亞硫酸鈉對肝臟的損傷作用并探討其引起肝細胞脂肪沉積的可能機制,為進一步研究食品添加劑亞硫酸鹽的健康危害提供可靠的理論基礎(chǔ),并為食品中亞硫酸鹽應用限量標準的修定提供一定的科學依據(jù)。 方法： 將正常人二倍體肝細胞株HL-7702(簡稱L-02)培養(yǎng)于含10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)基中,分別以

2、不同濃度的亞硫酸鈉(Na2SO3)作用于HL-7702細胞,其終濃度分別為0mmol/L、0.039mmol/L、0.156mmol/L、0.625mmol/L、2.5mmol/L,并設(shè)陽性對照組(乙醇,3％)。用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化；采用MTT法觀察亞硫酸鈉對肝細胞活力的影響；采用生化分析法檢測不同接觸時間后各染毒組肝細胞培養(yǎng)上清中乳酸脫氫酶(LDH)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的活性和白蛋白、總蛋白的含

3、量；采用酶比色法測定細胞內(nèi)甘油三酯(TG)的水平；應用免疫細胞化學方法檢測HL-7702肝細胞中與甘油三酯代謝密切相關(guān)的載脂蛋白B100(apo-B100)和載脂蛋白E(apo-E)的表達情況。 結(jié)果： 1、亞硫酸鈉對肝細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響：據(jù)倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),Na2SO3染毒24h后,對照組L-02肝細胞呈多邊形,單層排列,無重疊生長,細胞界限清晰,細胞貼壁良好；0.039mmol/L染毒組與對照組相比,細胞形態(tài)無明顯

4、變化；0.156mmol/L染毒組出現(xiàn)少量漂浮的圓形細胞,但仍可見大量正常形態(tài)細胞；0.625mmol/L染毒組圓形細胞數(shù)目增多；2.5mmol/L染毒組細胞的形態(tài)卻明顯異常,呈單個細胞貼壁,細胞數(shù)量減少、體積減小、許多細胞貼壁能力下降而呈漂浮狀態(tài)、死細胞增加及細胞間隙增大等。 2、亞硫酸鈉對L-02肝細胞活性的影響：據(jù)MTT比色法的檢測結(jié)果可見,當接觸染毒24h后,隨著Na2SO3濃度的增加,細胞活性抑制率逐漸升高,存在劑量-

5、反應關(guān)系(r=0.813,P<0.01)。其中0.625mmol/L和2.5mmol/L Na2SO3染毒組與對照組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),說明Na2SO3在一定范圍內(nèi)具有抑制肝細胞活性的能力。 3、亞硫酸鈉對肝細胞培養(yǎng)上清中LDH的影響：將肝細胞分別染毒24h、48h和72h后,隨著Na2SO3染毒濃度的增加,各染毒組肝細胞上清中LDH的活性逐漸升高,并存在明顯的劑量-反應關(guān)系(r24=0.841,p<0.0

6、1;r48=0.916,p<0.01;r72=0.619,p<0.01);說明Na2SO3可能對肝細胞膜的通透性有一定影響。 4、亞硫酸鈉對肝細胞培養(yǎng)上清中AST活性的影響： 1)在Na2SO3染毒后24h,隨著染毒濃度的增加,各染毒組肝細胞培養(yǎng)上清中AST的活性逐漸升高,其中0.625mmol/L組和2.5mmol/L組與陰性對照組比較有顯著性差異(p<0.05或p<0.01),并存在劑量-反應關(guān)系(r24=0.652

7、,p<0.01)。而在染毒48h和72h,各染毒組與對照組比較無統(tǒng)計學意義； 2)在相同濃度的NaSO3作用下,隨著作用時間的延長,肝細胞培養(yǎng)上清中AST的活性有逐漸降低的趨勢,48h和72h時間組與24h時間組比較有統(tǒng)計學意義(p<0.05或p<0.01)。 5、亞硫酸鈉對肝細胞培養(yǎng)上清中ALT活性的影響：當作用時間為24h、48h時,隨著Na2SO3染毒濃度的增加,肝細胞培養(yǎng)上清中ALT的活性逐漸升高,與對照組比較統(tǒng)

8、計學意義(p<0.05或p<0.01);其中染毒24h存在劑量-反應關(guān)系(r24=0.873,p<0.01)。而在染毒72h后,各染毒組與對照組之間的ALT不再具有顯著性差異。以上4、5觀察結(jié)果提示亞硫酸鈉對肝細胞的嚴重損傷作用主要表現(xiàn)在接觸早期。 6、亞硫酸鈉對肝細胞白蛋白和總蛋白合成的影響：在相同的作用時間條件下,隨著Na2SO3染毒濃度的增加,肝細胞培養(yǎng)上清中白蛋白和總蛋白的含量與陰性對照組比較無統(tǒng)計學意義(p>0.05)

9、;說明Na2SO3對肝細胞的白蛋白和總蛋白合成能力無明顯影響。 7、亞硫酸鈉對肝細胞內(nèi)TG水平的影響：當Na2SO3作用時間為24h和48h時,各染毒組HL-7702細胞內(nèi)TG含量無顯著性差異(p>0.05);在染毒后72h,0.625mmol/L組TG水平增加,與陰性對照組比較有統(tǒng)計學意義。 8、亞硫酸鈉對肝細胞apo-B100和apo-E表達的影響：根據(jù)免疫細胞化學檢測結(jié)果:Na2SO3接觸24h、48h和72h后,

10、各染毒組肝細胞內(nèi)apo-B100蛋白表達無明顯改變。Na2SO3作用72h后,2.5mmol/L組的apo-E蛋白表達水平明顯降低,與陰性對照組比較有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。提示亞硫酸鈉在一定劑量條件下可能對肝細胞中apo-E的含量有影響。 結(jié)論： 1、Na2SO3在一定條件下對HL-7702肝細胞活性存在一定的抑制作用。 2、Na2SO3在一定條件下可使肝細胞培養(yǎng)上清中LDH、AST、ALT的活性升高,提示