茉莉酸甲酯對(duì)甘草次生代謝的調(diào)控.pdf

1、甘草（Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma）作為我國(guó)大宗藥材，素有“十方九草”之稱，隨著現(xiàn)代藥理研究的深入，甘草藥材應(yīng)用愈加的廣泛，從而導(dǎo)致全球需求量急劇增加。然而，目前野生甘草資源的情況不容樂(lè)觀，人工栽培甘草技術(shù)欠缺和影響因素過(guò)多，導(dǎo)致人工栽培甘草的質(zhì)量和產(chǎn)量無(wú)法滿足市場(chǎng)要求。因此在適當(dāng)?shù)脑耘嘀芷?，采用人工干預(yù)方法是提高甘草質(zhì)量和緩解市場(chǎng)需求的有效途徑之一。
　　本論文開(kāi)展茉莉酸甲酯（MeJA）對(duì)甘草三萜類

2、有效成分甘草酸和黃酮類有效成分甘草苷的積累及相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的研究，探討MeJA對(duì)甘草根次生代謝的調(diào)控及其機(jī)制，為通過(guò)化學(xué)調(diào)控提高栽培甘草品質(zhì)提供依據(jù)。同時(shí)根據(jù)研究結(jié)果在甘草次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑，選擇GubAS基因進(jìn)行克隆和構(gòu)建表達(dá)載體，為后續(xù)獲得轉(zhuǎn)基因植株或轉(zhuǎn)基因毛狀根，研究該基因功能和培養(yǎng)甘草優(yōu)良品種及生物技術(shù)途徑生產(chǎn)甘草有效成分奠定基礎(chǔ)。
　　主要的研究方法及結(jié)果如下：
　　1.MeJA對(duì)甘草有效成分積累的調(diào)控：分

3、別用20、50、100μmol/L的MeJA處理6月齡甘草地上部分，每隔3天噴施一次，共噴施3次后取甘草根及根莖，利用HPLC測(cè)定甘草根中有效成分甘草酸和甘草苷的含量。MeJA溶液處理對(duì)甘草酸的積累有顯著影響，特別是濃度為20、50μmol/L MeJA溶液處理效果極為顯著。20、50μmol/L MeJA溶液對(duì)甘草苷的積累沒(méi)有顯著影響，而100μmol/LMeJA溶液處理則抑制了甘草苷的積累。由此表明適當(dāng)濃度的MeJA能促進(jìn)甘草根及根

4、莖中甘草酸的積累，而對(duì)甘草苷的積累無(wú)效果或有抑制效果。
　　2.MeJA對(duì)甘草次生代謝相關(guān)酶基因表達(dá)的調(diào)控：分別用20、50、100μmol/L的MeJA噴施6月齡甘草地上部分，處理后在2、6、12、24、36、72 h分別采收甘草根，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分析甘草根中甘草酸等三萜類成分生物合成相關(guān)酶β-香樹(shù)脂醇合酶（GubAS）、β-香樹(shù)脂醇-11-氧化酶（GubAO）基因和甘草苷等黃酮類成分生物合成相關(guān)酶6-脫氧查爾酮合酶（

5、GuDOCS）基因的相對(duì)表達(dá)水平。20μmol/L的MeJA溶液處理甘草0~6 h對(duì)GubAS、GuDOCS基因的表達(dá)均有一定促進(jìn)作用，處理2~6 h能提高GubAO的表達(dá)量。50μmol/L的MeJA溶液處理0~2 h對(duì)3個(gè)基因的表達(dá)水平都有提高作用，但該濃度的MeJA溶液處理6 h后對(duì)GuDOCS表達(dá)存在抑制現(xiàn)象。100μmol/L的MeJA溶液對(duì)GubAS和GubAO表達(dá)均無(wú)顯著影響；100μmol/L的MeJA溶液處理甘草2 h

6、時(shí)，GuDOCS表達(dá)量提高，隨后逐漸下降并在處理24 h后出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。試驗(yàn)結(jié)果表明中低濃度MeJA溶液在適當(dāng)?shù)奶幚頃r(shí)間對(duì)甘草酸的生物合成途徑相關(guān)酶GubAS、GubAO基因的表達(dá)有上調(diào)作用，促進(jìn)甘草酸的生物合成，但隨著MeJA溶液濃度的提高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，作用逐漸減弱。甘草苷生物合成途徑相關(guān)酶GuDOCS基因表達(dá)量只在低濃度的MeJA溶液處理組中提高，濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)抑制GuDOCS的表達(dá)。由此表明，低濃度MeJA溶液在

7、處理初期對(duì)甘草有效成分的積累及其生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)具有促進(jìn)作用；而隨著濃度提高或處理時(shí)間延長(zhǎng)，MeJA溶液促進(jìn)甘草有效成分積累及其生物合成途徑相關(guān)基因表達(dá)的作用逐漸減弱，甚至產(chǎn)生抑制作用。
　　3.GubAS克隆與表達(dá)載體構(gòu)建：利用本課題組前期應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)獲得的GubAS PCR擴(kuò)增并構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA克隆，將克隆質(zhì)粒pMD-GubAS轉(zhuǎn)化并雙酶切獲得全長(zhǎng)cDNA片段GubAS，將該片段與相同限制性內(nèi)切酶酶切并純化的p