水稻、玉米籽粒淀粉合成相關(guān)酶基因的分子調(diào)控研究.pdf

1、淀粉是水稻、玉米等農(nóng)作物籽粒中最主要的成分。根據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為直鏈淀粉和支鏈淀粉。高支鏈、低直鏈的淀粉主要用于食品業(yè)，而高直鏈、低支鏈的淀粉在醫(yī)療、紡織、環(huán)保等多個(gè)領(lǐng)域有著更為廣闊的市場(chǎng)前景，需求量巨大，但目前適合于特定用途的淀粉種質(zhì)卻極為缺乏，因此利用分子生物學(xué)的手段調(diào)控作物籽粒淀粉的合成，獲得新型種質(zhì)具有重要意義。淀粉是在一系列酶的作用下合成的，其中顆粒結(jié)合型淀粉合成酶Ⅰ（Granule-bound starch synthaseⅠ，

2、GBSSⅠ或Waxy）直接催化直鏈淀粉的合成，淀粉分支酶（starch branching enzyme，SBE）的一個(gè)同工型酶SBE3被認(rèn)為在形成支鏈淀粉過(guò)程中起到關(guān)鍵的作用。而蘋果酸脫氫酶（Malate dehydrogenase，MDH）則是生物糖代謝的關(guān)鍵酶之一。因此，調(diào)控這些淀粉合成相關(guān)酶基因就有可能改變作物籽粒淀粉的組成，獲得淀粉品質(zhì)更為優(yōu)良的新型種質(zhì)資源。為此，本實(shí)驗(yàn)以水稻和玉米為實(shí)驗(yàn)材料，采用過(guò)量表達(dá)和RNAi技術(shù)，分別

3、對(duì)Waxy基因，SBE3基因，MDH基因進(jìn)行了分子調(diào)控的研究。獲得了如下主要結(jié)果：
　　 1．在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下將SBE3基因RNA干擾表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻中花11，獲得了41株轉(zhuǎn)基因株，半定量RT-PCR檢測(cè)表明SBE3基因的表達(dá)量明顯降低。T1代農(nóng)藝性狀初步檢測(cè)顯示胚乳直鏈淀粉含量顯著升高，而千粒重卻顯著降低。進(jìn)一步對(duì)其T2代部分純系追蹤檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，直鏈淀粉含量均顯著高于未轉(zhuǎn)化水稻，單株最高達(dá)38.4％，提高了166.5％，而轉(zhuǎn)化植株

4、的有效穗粒數(shù)及千粒重均顯著降低。
　　 2．RNA干擾SBE3基因T3代2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的各淀粉合成關(guān)鍵酶酶活的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系SBE酶活性在籽粒發(fā)育各時(shí)期均顯著降低并提前3d達(dá)高峰期，且不同株系間具有差異。該基因酶活的下降也使籽粒發(fā)育不同時(shí)期的ADPG-PPase和SSS及DBE的酶活均不同程度的顯著降低。千粒重與直鏈淀粉含量檢測(cè)顯示，千粒重顯著低于未轉(zhuǎn)化植株，且大致的趨勢(shì)是直鏈淀粉含量越高，千粒重越小。這表明在淀粉的合成過(guò)

5、程中各關(guān)鍵酶不是孤立的發(fā)揮作用的，彼此間相互影響。SBE酶活的降低同時(shí)導(dǎo)致淀粉合成若干關(guān)鍵酶活性下降可能是轉(zhuǎn)基因株系千粒重顯著下降的一個(gè)重要原因。
　　 3．農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻全光照快速遺傳轉(zhuǎn)化體系，以粳稻中花11號(hào)為受體材料，將構(gòu)建的水稻W(wǎng)axy基因過(guò)量表達(dá)載體導(dǎo)入受體中花11，獲得了39株P(guān)CR檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株。建立了轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)體系。利用該體系檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中25株為單拷貝轉(zhuǎn)基因植株。半定

6、量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，T0代植株部分籽粒中Waxy基因的表達(dá)量明顯升高，且植株間存在差異。
　　 4． Waxy基因過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻T0代農(nóng)藝性狀的檢測(cè)顯示，與對(duì)照中花11相比，轉(zhuǎn)基因水稻千粒重、株高、穗長(zhǎng)，分蘗數(shù)及單穗實(shí)粒數(shù)都未能發(fā)生顯著變化，但T1種子糙米籽粒顏色變暗，透明度明顯降低，籽粒皺縮。直鏈淀粉百分含量測(cè)定顯示，轉(zhuǎn)基因水稻大部分植株的胚乳直鏈淀粉含量顯著提高，平均提高了42.72％，從未轉(zhuǎn)化水稻的14.28％，提

7、高到了20.38％，最高單株提高到29.18％，提高了104.3％。
　　 5．從玉米X178品種的葉片中克隆出了cyMDH基因，其全長(zhǎng)為1264bp。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該序列中包含1個(gè)70bp5’非翻譯區(qū)，1個(gè)195bp3’非翻譯區(qū)以及1個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框，該閱讀框從起始密碼子ATG到終止子TGA共記999bp，共編碼332個(gè)氨基酸（GenBank登陸號(hào)HU625276）。依據(jù)這個(gè)序列信息成功構(gòu)建了玉米cyMDH基因的R

8、NA干擾表達(dá)載體。
　　 6．通過(guò)對(duì)影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米轉(zhuǎn)化的各種因素的比較研究，確立了農(nóng)桿菌菌液濃度OD600值為0.7，AS濃度為100μmol/L，浸染時(shí)間為15min為適宜的轉(zhuǎn)化條件。初步建立了玉米cyMDH基因RNAi遺傳轉(zhuǎn)化體系。應(yīng)用該體系進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化獲得了5株P(guān)CR陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株。
　　 綜上所述，本研究利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)分別對(duì)水稻籽粒淀粉合成關(guān)鍵酶Waxy基因和SBE3基因進(jìn)行過(guò)量表達(dá)和RNAi分子調(diào)控，獲得了籽