家蠶Bmsxl基因自身剪接的調(diào)控機理研究.pdf

1、栽桑養(yǎng)蠶在中國已有五千年的歷史。在幾千年的家蠶養(yǎng)殖過程中，人們發(fā)現(xiàn)，家蠶的雌雄個體無論是在體型大小還是產(chǎn)絲量上都存在很大差異，雄蠶具有更高的經(jīng)濟應(yīng)用價值。同時，作為重要的鱗翅目昆蟲，家蠶的研究還可以作為模式，為基礎(chǔ)科學(xué)研究提供參考。因此對家蠶性別決定的研究，不僅對提高家蠶的經(jīng)濟價值具有重要意義，而且也將為進(jìn)一步了解昆蟲的生殖繁衍及病蟲害防治提供重要參考。在先前研究中發(fā)現(xiàn)BmSxl參與了家蠶性別決定通路，并且具有2種mRNA形式，編碼2種

2、不同形式的蛋白。為了進(jìn)一步了解BmSxl的自身剪接的機理，本文設(shè)計相關(guān)實驗對BmSxl自身剪接的上游調(diào)控因子和調(diào)控機理，以及與其他性別調(diào)控基因BmPSI、BmIMP和BmMasc的互作關(guān)系進(jìn)行了研究。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴家蠶中BmSxl有兩種剪接形式，BmSxl-PA和BmSxl-PB。二者的區(qū)別在于第八外顯子上的一小段序列，在BmSxl-PA中保留，而在BmSxl-PB中被剪接。為了調(diào)取到這小段序列被剪接（或保留）的上游

3、調(diào)控因子，本實驗首先設(shè)計引物，通過克隆得到在 BmSxl-PB中被剪切的那一小段序列，然后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得相應(yīng)的RNA序列。再將該序列進(jìn)行生物素標(biāo)記，從5齡3天家蠶精巢中提取核蛋白，通過RNA-Protein pull down獲得與該序列結(jié)合的蛋白。再通過SDS-PAGE電泳和銀染比對發(fā)現(xiàn)特異條帶，將特異條帶挖膠進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，共鑒定出46種蛋白。對這46種蛋白進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn)，其中 heterogeneous nuclear rib

4、onucleoprotein87F-like是一種剪接相關(guān)蛋白，并且有研究發(fā)現(xiàn)該蛋白在家蠶精巢中表達(dá)。考慮到 BmSxl-PB只在家蠶性腺中表達(dá)，并且在精巢的表達(dá)量高于卵巢。因此，該蛋白是BmSxl剪接的重要候選調(diào)控因子。⑵家蠶中heterogeneous nuclear ribonucleoprotein87F-like在NCBI上的登錄號為XP_004930561。該基因共編碼317個aa，約34KD，等電點為9.2，屬于堿性蛋白。

5、根據(jù)該蛋白的基因序列設(shè)計引物，以5齡3天家蠶的精巢cDNA為模板成功克隆到目的片段，并將該序列克隆到pET-28a(+)載體質(zhì)粒中，構(gòu)建原核表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)菌株中進(jìn)行原核表達(dá)。檢測發(fā)現(xiàn)該蛋白在誘導(dǎo)16℃的上清中表達(dá)量較高，并且通過親和層析獲得了較純的目的蛋白。⑶選擇性剪切除了需要剪接因子的參與，還與基因本身順式元件有很大關(guān)系。為了鑒定上游調(diào)控因子結(jié)合的順式元件，本實驗設(shè)計引物，將BmSxl第八外顯子內(nèi)部的剪接位點附

6、近，每10-12個堿基一組，進(jìn)行替換突變。并且突變的設(shè)置避開常規(guī)剪接所需的必要位點，共獲得突變17組。將17組突變的第八外顯子序列克隆到1180[Hrs-BmAct4-LUC-Ser1PA]上，并轉(zhuǎn)染至家蠶的卵巢細(xì)胞，48h后提取RNA進(jìn)行RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)GCCTTGGGCA/ACACGGACGA/ACGCTTCAAA/TAATCCAACA/CATCGCGGTT/GCTTAAAGGAAC這6組堿基發(fā)生突變時，BmSxl-PB形式

7、消失。說明這6組堿基序列很可能與BmSxl的剪接調(diào)控有關(guān)。⑷針對此6組堿基序列和剪接因子heterogeneous nuclear ribonucleoprotein87F-like之間是否存在結(jié)合這一問題，我們首先把這6組堿基序列制成RNA探針，通過EMSA進(jìn)行實驗驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)heterogeneous nuclear ribonucleoprotein87F-like與探針GCCUUGGGCA可以特異性結(jié)合。這些結(jié)果顯示heter

8、ogeneous nuclear ribonucleoprotein87F-like可以通過結(jié)合GCCUUGGGCA序列對BmSxl的剪接進(jìn)行調(diào)控。⑸Bmdsx是家蠶性別調(diào)控網(wǎng)絡(luò)下游的開關(guān)基因，BmSXL可以與Bmdsx的多聚U序列結(jié)合，促進(jìn)Bmdsx發(fā)生雄特異性剪接。BmPSI、BmIMP、BmMasc也是調(diào)控Bmdsx發(fā)生雄特異性剪接的重要因子。為了進(jìn)一步確定BmSXL與BmPSI、BmIMP和BmMasc的關(guān)系，首先設(shè)計引物并從5