家蠶DnaJ基因家族的研究.pdf

1、在家蠶EST文庫(kù)中，許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)了有關(guān)細(xì)胞凋亡基因、組織分化基因、蛋白酶抑制劑、抗菌肽基因等許多已知功能EST，以及組織和時(shí)期特異表達(dá)基因，是家蠶分子生物學(xué)研究的活躍領(lǐng)域。本文通過(guò)檢索家蠶EST文庫(kù)，獲得一系列同源性的EST，構(gòu)建了家蠶DnaJ家族，并分析了其序列及組織表達(dá)分布。
　　 從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的家蠶蛹cDNA文庫(kù)中獲得了一個(gè)新的編碼家蠶DnaJ蛋白的EST序列，以該序列為探針，BLAST檢索GenBank中的家蠶EST數(shù)

2、據(jù)庫(kù)，拼接同源的EST序列，獲得一個(gè)新的DnaJ基因cDNA全序列，此序列包含一個(gè)1227bp的開(kāi)放閱讀框，編碼一個(gè)完整的DnaJ蛋白，含有三個(gè)結(jié)構(gòu)域，我們用此DnaJ蛋白的保守區(qū)搜索家蠶EST庫(kù)，共檢索到190條與其同源的家蠶EST序列，應(yīng)用DNAStar、Clusta.X程序進(jìn)行分類拼接，獲得十三個(gè)都具有部分DnaJ保守區(qū)的基因片段，組成一個(gè)基因家族，且與果蠅的DnaJ有同源性故命名為家蠶DnaJ家族(Bm-Dna.family)。

3、
　　 應(yīng)用cDNA末端快速擴(kuò)增的方法補(bǔ)全了其中四個(gè)家族成員(Bm-DnaJ1，Bm-DnaJ8.Bm-DnaJ1.an.Bm-DnaJ11)，這十三個(gè)成員都有一個(gè)保守、完整的DnaJ結(jié)構(gòu)域，通過(guò)分析，基因間同源性比較低。同時(shí)我們也補(bǔ)全了其中兩個(gè)成員的基因組序列。
　　 用RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了家蠶DnaJ家族各成員在家蠶五齡幼蟲(chóng)期不同組織器官中的表達(dá)情況，從組織表達(dá)分布上看，Bm-DnaJ1，Bm-Dn

4、aJ2和Bm-DnaJ4只在部分組織有表達(dá)，其他十個(gè)基因在所有組織器官都有表達(dá)。
　　 通過(guò)PCR擴(kuò)增得到Bm-DnaJ1基因C端的一段序列，將其插入到pET28a(+)表達(dá)載體的Bam.I和Hin.III酶切位點(diǎn)之間，獲得重組質(zhì)粒pET28a(+)-Bm-DnaJ1，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，超聲破碎，用鎳親和柱得到純化的蛋白。再用純化的蛋白免疫一只雄性新西蘭大白兔，獲得多克隆抗血清，間