BmFoxO基因調(diào)控家蠶壽命的分子機制研究.pdf

1、實驗動物是現(xiàn)代生命科學研究的重要基礎(chǔ)和強力支撐。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，越來越多的實驗動物被應(yīng)用到生命科學研究中。長久以來，益壽延年一直是人類追求的夢想，因此，衰老和壽命決定機制研究一直是生命科學領(lǐng)域的熱點。
　　目前應(yīng)用于壽命研究的無脊椎動物模型主要包括秀麗隱桿線蟲和黑腹果蠅，脊椎動物模型主要包括小鼠和猴子。由于衰老和壽命調(diào)控機制的復雜性，模式生物在該領(lǐng)域研究中的利用至關(guān)重要。其中，身體構(gòu)造簡單而器官分化卻相對完整的無脊椎實驗動物受

2、到廣大研究者的青睞。至今，少數(shù)的無脊椎動物模型并不能完全滿足復雜的壽命機制研究的需要，新型實驗動物的開發(fā)利用十分必要。
　　數(shù)千年的馴養(yǎng)和蠶業(yè)發(fā)展賦予了家蠶獨特的生物學特點及文化內(nèi)涵。長達一個世紀收集和研究積淀了豐富的突變資源，以及率先開展了基因組和功能基因組研究，為家蠶的拓展利用提供了良好的基礎(chǔ)。同時，家蠶也具備諸多作為壽命研究的實驗動物的特征，如生命周期和個體大小適中、繁殖力強、發(fā)育階段界限清晰、外源注射所導致的物理損傷較小、

3、壽命可塑性較強及不存在倫理問題等。有鑒于此，本研究選擇家蠶作為實驗動物，鑒定重要壽命基因及分析基因調(diào)控家蠶壽命的機制，為壽命決定分子機制的闡釋提供新的認知。主要獲得了如下研究結(jié)果：
　　1.家蠶壽命與BmFoxO基因表達量間的關(guān)系
　　家蠶各品系的發(fā)育時長不同，壽命也存在差異。從家蠶基因庫中選取一組品系進行壽命統(tǒng)計，并對其中的三個代表性品系（夏芳、Dazao-N、N4）進行壽命相關(guān)基因表達模式的調(diào)查，結(jié)果顯示：夏芳的平均壽命

4、和最大壽命均較長，Dazao-N次之，N4品系的平均壽命和最大壽命較短。鑒于FoxO在多個物種中被報道是調(diào)控壽命的關(guān)鍵因子，我們調(diào)查了這些品系中BmFoxO在不同發(fā)育時期的表達水平，發(fā)現(xiàn)在蛹10天（可能決定成蟲壽命的時間點），BmFoxO的表達量為夏芳顯著高于Dazao-N和N4，并且N4顯著低于Dazao-N。同時，在被調(diào)查的其他發(fā)育時期，BmFoxO表達趨勢與相應(yīng)品系的壽命也呈現(xiàn)出高度一致。通過控制家蠶飲食攝入量，成功構(gòu)建了家蠶飲食

5、限制實驗?zāi)Ｐ停粔勖y(tǒng)計結(jié)果表明飲食限制組壽命明顯長于對照組，并且BmFoxO表達量顯著高于對照組。鑒于BmFoxO的表達與壽命顯著相關(guān)，所以推測該基因發(fā)揮了調(diào)控家蠶壽命的功能。
　　2.家蠶Fox基因家族的鑒定與進化分析
　　Fox基因編碼的是一個轉(zhuǎn)錄因子家族，包含23個亞家族（FoxA-FoxS）。在家蠶中利用隱馬爾可夫模型對Fox基因家族成員進行全基因組的分析鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)家蠶中含有17個Fox家族成員。通過系統(tǒng)發(fā)生分析

6、，將這17個Fox家族基因歸類于13個Fox亞家族。對其所屬的染色體位置進行分析發(fā)現(xiàn)這些成員分布于13條不同的染色體上。利用相同的隱馬爾可夫模型識別紅帶袖蝶、帝王蝶、果蠅、小鼠和人類中的Fox基因家族成員，并利用這些序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果表明不同物種中的直系同源基因間序列高度保守。同時，對家蠶中 Fox家族基因的結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特征分析，表明家蠶中 Fox基因大多屬于單外顯子基因，蛋白均包含有保守的Fork head結(jié)構(gòu)域。家蠶中F

7、ox家族基因的GO注釋表明，其編碼產(chǎn)物除未參與核孔復合體的生物合成過程外，參與了生物體內(nèi)的諸多其他生物學過程。對家蠶中的Fox家族成員進行選擇壓力分析，結(jié)果表明Fox家族蛋白的結(jié)構(gòu)域受到強烈的純化選擇。在系統(tǒng)發(fā)生分析中，依據(jù)參考序列對家蠶Fox基因家族中的每個成員進行了命名；同時發(fā)現(xiàn)FoxK亞家族在家蠶中特異性缺失。
　　3.BmFoxO在調(diào)控壽命中的功能探究
　　為了探索BmFoxO基因在壽命調(diào)控過程中的作用，進行了BmF

8、oxO的干涉實驗。鑒于BmFoxO在家蠶羽化1天的血淋巴中表達量較高，選擇此時期的血淋巴作為BmFoxO干涉的組織，設(shè)計并合成特異的BmFoxO雙鏈RNA干涉片段（BmFoxO-dsRNA）。由于雙鏈干涉發(fā)揮效應(yīng)需要一定時間，利用家蠶外源注射技術(shù)將BmFoxO-dsRNA通過家蠶氣孔注入家蠶蛹10天的血淋巴中。結(jié)果表明，BmFoxO-dsRNA能夠顯著降低BmFoxO的表達水平，進而顯著縮短家蠶成蟲期的壽命。為了探測 BmFoxO的過表

9、達能否延長家蠶成蟲期壽命，構(gòu)建了piggyBac-IE1-BmFoxO-SV40過表達載體并將其導入蛹10天家蠶血淋巴中，BmFoxO的表達水平檢測發(fā)現(xiàn)其在注射后42h被顯著上調(diào)。壽命統(tǒng)計結(jié)果表明，與對照組相比，過表達BmFoxO能夠顯著延長家蠶成蟲期的平均壽命和最大壽命。利用Crispr-Cas9技術(shù)對BmFoxO進行敲除，分子檢測表明G1代家蠶中BmFoxO的基因組序列確實發(fā)生了編輯。后續(xù)研究需要確定其能否對G2代家蠶的壽命產(chǎn)生影響

10、。
　　4.BmFoxO的靶基因篩選及其對壽命的影響
　　BmFoxO表達水平的升高能夠顯著延長家蠶個體壽命已經(jīng)得到了證實，然而其延長壽命的分子機制仍需要進一步研究。由于BmFoxO屬于轉(zhuǎn)錄因子，其在執(zhí)行功能過程中需要通過調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性來實現(xiàn)，因此FoxO下游靶基因的篩查和鑒定將為FoxO調(diào)控壽命的機制解析提供清晰的方向。構(gòu)建BmFoxO組成型過表達和干涉載體，轉(zhuǎn)染家蠶BmN-SWU1細胞，經(jīng)抗生素篩選后，獲得了較

11、為穩(wěn)定的BmFoxO組成型過表達和干涉的細胞系。免疫熒光和western實驗檢測發(fā)現(xiàn)，BmFoxO組成型過表達載體轉(zhuǎn)染后表達的蛋白位于細胞核中，能夠發(fā)揮調(diào)控靶基因的功能。定量檢測確認組成型過表達和干涉細胞系中BmFoxO的表達水平，相比于對照組確實被上調(diào)和下調(diào)。就BmFoxO組成型過表達和干涉的細胞系取材提取RNA，進行表達譜測序。結(jié)合本小組唐冬梅對表達譜測序結(jié)果的分析所發(fā)現(xiàn)的符合正調(diào)控或負調(diào)控的差異表達基因共212個；我們結(jié)合果蠅Fo

12、xO靶基因的對比分析和多層篩選，最終選出家蠶和果蠅靶基因中共有的基因2個和家蠶中特有的基因5個。對篩選到的這7個基因的上游調(diào)控序列進行克隆，成功構(gòu)建其中5個基因的雙熒光素酶報告載體。雙熒光素酶報告結(jié)果顯示，5個篩選到的基因均受到BmFoxO的調(diào)控，其中 BGIBMGA002356基因受到的調(diào)控最為強烈。為了探測BGIBMGA002356基因是否參與家蠶壽命的調(diào)控過程，在家蠶蛹10天對其進行了基因的雙鏈干涉實驗。結(jié)果表明干涉BGIBMGA

13、002356基因后，其在羽化后12h的表達水平被顯著下調(diào)，同時家蠶成蟲期壽命被顯著縮短。
　　綜上所述，我們證明了BmFoxO基因能夠調(diào)控家蠶壽命，同時鑒定到FoxO下游的一個新的靶基因BGIBMGA002356，并通過實驗證明了該靶基因受到BmFoxO的直接調(diào)控，且能夠調(diào)控家蠶壽命。我們推測BGIBMGA002356可能參與了BmFoxO調(diào)控家蠶壽命的過程，這極有可能是FoxO調(diào)控壽命的一條新的路徑。本研究不僅進一步豐富了我們對