團(tuán)頭魴缺氧應(yīng)答相關(guān)基因的分子調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)屬不耐低氧的鯉科魚類。在大規(guī)模經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖中極易缺氧,成為限制其產(chǎn)量的主因素。在動物耐受低氧的生理應(yīng)答的分子機(jī)制中,一系列氧敏感基因的轉(zhuǎn)錄、調(diào)控諸如物質(zhì)和能量代謝、血管生成以及細(xì)胞增殖和凋亡等生理過程,從而維持機(jī)體在缺氧狀態(tài)下的存活。目前脊椎動物中已發(fā)現(xiàn)IGFBP-1(胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白1)和EPO(促紅細(xì)胞生成素)對低氧環(huán)境非常敏感;在經(jīng)濟(jì)魚類中,它們分子水平上的研究非常有限

2、,例如結(jié)構(gòu)、表達(dá)特征的調(diào)控機(jī)制。通過克隆團(tuán)頭魴IGFBP-1及EPOcDNA全長,分析其結(jié)構(gòu)、功能及其調(diào)控因素,對解釋團(tuán)頭魴不耐低氧的分子機(jī)制和耐低氧團(tuán)頭魴良種的選育有著重要的研究意義。
　　本研究一方面通過RT-PCR和RACE技術(shù)克隆獲得了團(tuán)頭魴IGFBP-1和EPO的cDNA全長序列,分別為1135bp和903bp,其ORF開放閱讀框分別為789bp和552bp,可編碼262和183個氨基酸殘基。通過信息學(xué)軟件分析表明,團(tuán)頭

3、魴IGFBP-1的N端(含典型IGFBP蛋白家族基序)及C端(含一個甲狀腺球蛋白結(jié)合位點)結(jié)構(gòu)域具有較高的保守性。團(tuán)頭魴 EPO蛋白分子中有三個 N-連接和一個 O-連接糖基化位點;N端含有與EPO分子成熟相關(guān)的信號前肽。
　　通過半定量RT-PCR檢測,分析了團(tuán)頭魴胚胎和成魚各組織中IGFBP-1及EPO mRNA的時空表達(dá)。在常氧狀態(tài)下,團(tuán)頭魴IGFBP-1表達(dá)量隨著胚胎發(fā)育過程逐漸增加;EPO在整個胚胎發(fā)育時期表達(dá)量均較為恒

4、定,無明顯差異,進(jìn)一步經(jīng)整胚原位雜交探針檢測結(jié)果與RT-PCR結(jié)果相一致,空間上EPOmRNA主要在胚胎的前、中、后腦表達(dá)。在團(tuán)頭魴成魚不同組織中,所有被檢測組織中 IGFBP-1均有mRNA表達(dá),其中以肝臟、腸和心臟中表達(dá)水平較高。而EPO mRNA在除肝、腦和心臟以外的其他組織中均未檢測到。缺氧(溶氧值約1.0mg/l)4h后,IGFBP-1 mRNA水平在皮膚、肝臟、腎臟、脾臟、腸、和心臟中分別為對照組的23.3、21.0、32.

5、7、26.1、19.0和32.0倍;恢復(fù)水中溶氧24h后,各個組織中IGFBP-1轉(zhuǎn)錄水平均恢復(fù)到正常組水平。缺氧(溶氧值約1.0mg/l)4h后,EPO在腦、肝和心臟中的轉(zhuǎn)錄水平有顯著變化,分別為對照組的19.8、20.1和39.4倍;并且腎臟組織中出現(xiàn)微量表達(dá)。平行實驗組恢復(fù)水中溶氧24h后，EPO表達(dá)量在所檢測的組織中均降至正常組水平;腎臟組織中幾乎檢測不到EPO mRNA。研究結(jié)果推測團(tuán)頭魴IGFBP-1和EPO在團(tuán)頭魴缺氧應(yīng)答

6、過程中發(fā)揮了重要的作用。本研究為探索團(tuán)頭魴在缺氧環(huán)境中分子水平的調(diào)控機(jī)制提供了一定的實驗依據(jù)。
　　在碩士論文研究階段,還對金魚不同品系Tgf2轉(zhuǎn)座子的側(cè)翼序列及拷貝數(shù)進(jìn)行了擴(kuò)增及鑒定,建立一種可檢測Tgf2轉(zhuǎn)座子在金魚基因組插入拷貝數(shù)和側(cè)翼序列的接頭反向新方法。在金魚(Carassius auratus)的珍珠品系中尋找具有天然有活性的Tgf2轉(zhuǎn)座子的個體,獲得了珍珠Tgf2轉(zhuǎn)座子兩端的側(cè)翼DNA序列;發(fā)現(xiàn)在左臂末端和右臂末端有