團頭魴視黃醇結合蛋白相關基因的克隆及分析.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、團頭魴(Megalobrama amblycephala)屬于鯉科草食性魚類,分布于長江中下游區(qū)域的附屬中型湖泊中,有生長較快、抗病力強、適溫范圍廣、疾病少、易捕撈、肉肥質嫩、營養(yǎng)豐富等諸多優(yōu)點,被認為是一種優(yōu)良的淡水經(jīng)濟魚類,近年來國內對團頭魴進化、免疫、抗病力等方面的研究較多。本研究的主要內容包括視黃醇結合蛋白(retinol binding protein,RBP)及胞內視黃醇結合蛋白(cellularretinol-bindin

2、g protein,CRBP)基因的分子克隆,分析RBP基因在團頭魴不同發(fā)育時期以及不同組織中的表達情況。主要研究結果如下:
  1.團頭魴血清視黃醇結合蛋白基因的克隆及序列分析本研究獲得了團頭魴rbp4的cDNA全長(815 bp)和基因組DNA全長(4915bp)。采用生物信息學技術進行分析,結果顯示:團頭魴rbp4基因由五個外顯子和四個內含予組成,符合GT/AG規(guī)則。其開放閱讀框有579bp,共編碼192個氨基酸,5'端區(qū)域

3、有34 bp,3'端有202 bp。通過對比不同物種的rbp4基因編碼的氨基酸序列發(fā)現(xiàn),相比其他物種,團頭魴的rbp4編碼的氨基酸序列與鯉(80%)、胡予鯰(93%)、斑馬魚(88%)、虹鱒(82%)、青鳉(70%)、紅鰭東方鲀(71%)等都有較高的同源性,而與綠海龜(64%)、家貓(59%)、牛(58%)、人(58%)則同源性相對較低。
  2.團頭魴目的基因的時空表達譜對團頭魴rbp1b、rbp2a、rbp4三個基因進行了熒光

4、定量PCR,得到了三個基因在團頭魴不同發(fā)育時期以及不同組織中的表達譜,分析結果可看出,三種基因在不同組織中的mRNA表達量存在著顯著差異,rbp1b在腎臟和脾臟中有高表達,在小腸、眼睛等器官中則表達量極低或基本未見表達;rbp2a和rbp4則在肝臟中高表達,其中rbp2a在小腸中有少量表達,而在眼球中則基本未見表達;rbp4在眼球中有少量表達,小腸中則基本未見表達。除此之外,同一基因在不同發(fā)育時期也會有明顯的表達量的變化:rbp1b在團

5、頭魴胚胎發(fā)育早期持續(xù)表達,出膜后7天內表達量持續(xù)升高;rbp2a和rbp4則在胚胎發(fā)育早期表達量都極低或基木未見表達,在出膜前后才有較高的表達。
  3.團頭魴rbp4啟動子克隆利用熱不對稱PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)法擴增得到團頭魴rbp4基因的上游核心啟動子序列,同時對來自三個不同地理種群樣本進行啟動子的檢測,發(fā)現(xiàn)并驗證了兩個SNP位點,-385A>G以及-32

6、9C>T,經(jīng)過CRS-PCR(created restriction site PCR)法檢測之后,計算了三個不同地理種群中兩個突變位點的基因型及基因頻率。
  4.9-順式維甲酸對rbp4啟動子活性的影響將單倍型385G-329T和385A-329C構建重組載體,轉染細胞并通過雙熒光素酶檢測顯示,在一定濃度內,9-順式維甲酸對rbp4啟動予的活性有明顯的促進作用。另外,兩種不同基因型重組載體也存在著差異,低濃度(10 nM)時p

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