雌二醇,皮質(zhì)醇對(duì)團(tuán)頭魴垂體糖蛋白激素a亞基基因表達(dá)的影響及其基因啟動(dòng)子缺失表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、本論文首先運(yùn)用RACE方法克隆得到了團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)垂體糖蛋白激素α亞基(PGPHα)cDNA全長(zhǎng)，并對(duì)其序列進(jìn)行了分析。然后運(yùn)用SYBR GreenⅠ熒光定量PCR的方法檢測(cè)了外源性雌二醇(E2)，皮質(zhì)醇(Cortisol)對(duì)團(tuán)頭魴PGPHα亞基基因表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：實(shí)驗(yàn)分為57％酒精注射對(duì)照組，雌二醇(0.5mg/kg體重)注射實(shí)驗(yàn)組和皮質(zhì)醇(0.2mg/kg體重)注射實(shí)驗(yàn)組(兩種激素均

2、以57％的酒精作為溶劑)，同時(shí)還設(shè)立了空白實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)每?jī)芍茏⑸湟淮危⑸?次和4次后的第3天取樣。最后，為進(jìn)一步探討團(tuán)頭魴PGPHα亞基基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制，本文運(yùn)用PCR-末端加尾法克隆了團(tuán)頭魴PGPHα亞基基因5’端側(cè)翼序列，并在進(jìn)行生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上構(gòu)建了一系列的缺失表達(dá)載體。本論文的完成，填補(bǔ)了從基因水平研究團(tuán)頭魴PGPHα亞基的空白，為基因重組型團(tuán)頭魴“全魚(yú)”促性腺激素及其類(lèi)似物的研究奠定了理論基礎(chǔ)，同時(shí)為健康養(yǎng)殖及環(huán)

3、境保護(hù)相關(guān)法律法規(guī)的制定提供科學(xué)依據(jù)。此外，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本論文還提出了皮質(zhì)醇導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)繁殖力下降的可能的分子機(jī)制。
　　 1.團(tuán)頭魴PGPHα亞基cDNA的克隆和序列分析
　　 運(yùn)用RACE法克隆得到了團(tuán)頭魴PGPHα亞基cDNA全長(zhǎng)序列。該cDNA全長(zhǎng)859bp，包括45 bp的5’端非翻譯區(qū)，427bp的3’端非翻譯區(qū)，357 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)以及30bp的PolyA序列，加尾信號(hào)ATTAAA位于807bp

4、處。團(tuán)頭魴PGPHα亞基ORF區(qū)編碼了118個(gè)氨基酸，包括23個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽序列及95個(gè)氨基酸殘基的成熟肽序列。序列分析結(jié)果顯示：團(tuán)頭魴PGPHα亞基的氨基酸序列與草魚(yú)(Ctenopharyngodon idella)的同源性最高，為100％；其次為鯉魚(yú)、鰱魚(yú)，同源性均達(dá)到98.9％；與庸鰈的同源性最低，但氨基酸序列的相似性也達(dá)到58％。由此表明，PGPHα亞基在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中具有很高的保守性。團(tuán)頭魴PGPHα亞基的核酸與氨基酸

5、序列與鯉科魚(yú)類(lèi)的相應(yīng)序列顯示出很高的同源性，表明其親緣關(guān)系非常接近，與根據(jù)已知魚(yú)類(lèi)PGPHα亞基氨基酸序列所做的進(jìn)化分析結(jié)果一致，也符合目前公認(rèn)的分類(lèi)關(guān)系。此外，在PGPHα亞基成熟肽序列中存在10個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基，2個(gè)保守的N-糖基化位點(diǎn)以及三個(gè)高度保守的脯氨酸殘基。
　　 2.外源性雌二醇，皮質(zhì)醇對(duì)團(tuán)頭魴PGPHα亞基基因表達(dá)的影響
　　 運(yùn)用SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法分析了外源性皮質(zhì)醇和雌二醇

6、對(duì)團(tuán)頭魴PGPHα亞基基因表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為8周，實(shí)驗(yàn)組每?jī)芍芊謩e注射一次0.2 mg/kg體重的皮質(zhì)醇以及0.5 mg/kg體重的雌二醇(均用57％酒精溶解)，對(duì)照組注射同劑量的57％酒精，同時(shí)設(shè)置了空白實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)期間沒(méi)有投喂飼料。在本實(shí)驗(yàn)條件下，研究結(jié)果顯示：注射2次與注射4次雌二醇對(duì)團(tuán)頭魴PGPHα亞基基因表達(dá)無(wú)顯著影響。注射2次皮質(zhì)醇后，PGPHα亞基的表達(dá)出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異；注射4次后，PGPHα亞

7、基表達(dá)量降低，且與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)；另外，對(duì)照組與空白實(shí)驗(yàn)組相比，PGPHα亞基基因的表達(dá)量無(wú)顯著差異，表明實(shí)驗(yàn)操作并未對(duì)團(tuán)頭魴PGPHα亞基基因表達(dá)造成顯著的影響。
　　 3.團(tuán)頭魴PGPHα亞基基因5’端側(cè)翼序列克隆及其表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 首先運(yùn)用PCR-末端加尾法克隆了團(tuán)頭魴PGPHα亞基基因5’端側(cè)翼序列；然后利用生物信息學(xué)理論對(duì)該序列進(jìn)行了序列分析；最后在序列分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了熒光素

8、酶質(zhì)粒表達(dá)載體。序列分析結(jié)果顯示：克隆所得到的團(tuán)頭魴PGPHα亞基基因5’端側(cè)翼序列長(zhǎng)1399bp；其序列中包含潛在的TATA盒、GC盒，以及ERE、TRE、CRE、PGBE等對(duì)PGPHα亞基基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控起重要作用的功能轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；啟動(dòng)子區(qū)域位于-40～10bp處。利用PCR方法擴(kuò)增得到了全長(zhǎng)-1399～+40bp以及-1080～+40bp、-492～+40bp、-133-+40bp的缺失片段，并將其連接至pGL3-Basic報(bào)告