花粉-種子表達(dá)融合啟動(dòng)子合成及其表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、轉(zhuǎn)基因植物的生物安全性自植物基因工程誕生之日起，就一直受到人們的關(guān)注。其中，轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境安全性，是其得到田間釋放和應(yīng)用推廣的審批前提條件之一。理想的環(huán)境安全性轉(zhuǎn)基因植物，是對(duì)環(huán)境友好、不將攜帶的轉(zhuǎn)基因成分?jǐn)U散給非轉(zhuǎn)基因植物。花粉和種子均不育或花粉和種子均在形成階段失去所有母體中存在的轉(zhuǎn)基因成分，將是創(chuàng)制理想的環(huán)境安全性轉(zhuǎn)基因植物的可能途徑。迄今，通過(guò)基因工程手段，既可以使花粉或種子不育，也可是使轉(zhuǎn)基因在花粉和種子發(fā)育階段定期被刪除，

2、而且該技術(shù)在無(wú)性繁殖植物的轉(zhuǎn)基因利用上幾乎沒用問題，但在有性繁殖植物的轉(zhuǎn)基因利用(尤其是F1組合)上卻增加了制種和應(yīng)用的難度，成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者競(jìng)相研究的難題。要解決這一難題的重要途徑之一是擁有嚴(yán)緊、高效、特異表達(dá)的花粉/種子啟動(dòng)子，而且該啟動(dòng)子能夠被誘導(dǎo)關(guān)閉，以便得到可育的花粉和種子或者得到轉(zhuǎn)基因未被刪除的花粉和種子，從而使轉(zhuǎn)基因得到純合、轉(zhuǎn)基因純合材料得到繁殖。本實(shí)驗(yàn)室已建立了一個(gè)四環(huán)素負(fù)調(diào)控系統(tǒng)，但缺乏花粉/種子特異表達(dá)啟動(dòng)子，因此，

3、本實(shí)驗(yàn)從番茄基因組中擴(kuò)增出了花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子LAT52，與種子特異啟動(dòng)子的控制元件相拼接，合成了人工花粉/種子特異表達(dá)融合啟動(dòng)子，并和GUS報(bào)告基因拼接，構(gòu)建成雙元表達(dá)載體；經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)將雙元表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入煙草與擬南芥中，以期分析和驗(yàn)證該花粉/種子啟動(dòng)子表達(dá)的嚴(yán)緊性、高效性和特異性。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1.克隆了番茄花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子LAT52
　　 以番茄為模版，采用半巢式PCR擴(kuò)增方法，得到618bp的目的

4、條帶。克隆進(jìn)含有種子特異啟動(dòng)子的pMD18-T載體后，獲得重組質(zhì)粒pMD-LAT52。序列測(cè)定后，與GenBank公布的序列(X15855)進(jìn)行比對(duì)，相似度為98％，僅在非關(guān)鍵區(qū)多出7個(gè)堿基，在多A串聯(lián)區(qū)的中少一個(gè)A；其中，多出的7個(gè)堿基AAAAAAT是一個(gè)簡(jiǎn)單序列重復(fù)(simple sequence repeat，SSR)，在該變異位點(diǎn)有4個(gè)重復(fù)，比GenBank登記的序列增加了一個(gè)。
　　 2.構(gòu)建了帶有種子/花粉表達(dá)融合啟

5、動(dòng)子LAT52Sd和GUS報(bào)告基因的雙元表達(dá)載體
　　 將豌豆種子特異表達(dá)基因啟動(dòng)子的重要控制元件與番茄花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子LAT52相拼接，構(gòu)成種子/花粉表達(dá)融合啟動(dòng)子LAT52Sd，并構(gòu)建了帶有LAT52Sd-GUS表達(dá)盒的雙元表達(dá)載體。
　　 3.LAT52Sd-GUS基因?qū)霟煵莺蛿M南芥
　　 采用葉盤法經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)在150mg/L卡那霉素的篩選壓下篩選，得到卡那霉素抗性煙草植株。在50mg/L卡那霉素的篩