人視黃醇結(jié)合蛋白4多克隆抗血清的制備及初步應(yīng)用.pdf

1、目的:制備抗人視黃醇結(jié)合蛋白4(Retinal binding protein4，RBP4)的多克隆抗血清，初步應(yīng)用于2型糖尿?。═2DM）患者的血清RBP4檢測(cè)。
　　 方法:從成人正常肝臟組織中提取總RNA，RT-PCR法擴(kuò)增人RBP4 cDNA全長(zhǎng)，與pMD-18T Vector相連，構(gòu)建克隆載體pMD-hRBP4。設(shè)計(jì)分別帶BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)的上下游引物，PCR后酶切，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a(+)-hR

2、BP4，氯化鈣法轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)，提取質(zhì)粒雙酶切鑒定并測(cè)序，將IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物用western blotting鑒定。對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的條件如IPTG的濃度、時(shí)間和溫度等進(jìn)行優(yōu)化，鎳親和層析法純化rhRBP4，免疫新西蘭大白兔，制備多克隆抗血清，Western blotting檢測(cè)其特異性，ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)。用多克隆抗血清檢測(cè)T2DM患者血清RBP4水平。
　　 結(jié)果:重組質(zhì)粒pET-28a(+)-hRBP

3、4的雙酶切結(jié)果與預(yù)期大小完全一致，測(cè)序結(jié)果證實(shí)所得的cDNA序列與GenBank中hRBP4的序列基本一致，Western blotting結(jié)果證實(shí)重組蛋白能夠與hRBP4單克隆抗體特異性結(jié)合。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的最適濃度是0.04 mmol/L，最適時(shí)間為6 h，最適溫度為37℃，表達(dá)的重組蛋白最多可達(dá)菌體總蛋白的44％，且以包涵體形式存在。SDS-PAGE電泳的結(jié)果表明親和層析法得到的重組蛋白純度為96％。ELISA法測(cè)定抗血清的效價(jià)