團(tuán)頭魴生長(zhǎng)相關(guān)基因(MSTN, Mdk)的克隆及熱休克誘導(dǎo)四倍體初步研究.pdf

1、團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)，由于其生殖周期短、二齡即可達(dá)到性成熟，是研究肌肉生長(zhǎng)、選育新品種的良好材料。
　　肌肉生長(zhǎng)抑制素(Myostatin,MSTN)，又稱生長(zhǎng)分化因子8(Growth differentiation factor8,GDF8)，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming growth factorβ,TGF-β)家族。該基因抑制骨骼肌的生長(zhǎng)、發(fā)育。本研究通過(guò)cDNA末端快速

2、擴(kuò)增法(RACE法)克隆得到團(tuán)頭魴生長(zhǎng)抑制素(MSTN)基因全長(zhǎng)cDNA序列并分析了MSTN基因在團(tuán)頭魴胚胎、成魚組織中表達(dá)以及MSTN基因在胚胎中過(guò)表達(dá)情況。結(jié)果顯示團(tuán)頭魴MSTN基因的cDNA全長(zhǎng)為2187bp，編碼區(qū)ORF(開放閱讀框)大小為1128bp，編碼376個(gè)氨基酸，推測(cè)的MSTN前體蛋白等電點(diǎn)為5.02，相對(duì)分子質(zhì)量為92.34KDa。MSTN基因編碼蛋白包含有兩大TGF-β蛋白結(jié)構(gòu)域、RXXR蛋白酶水解位點(diǎn)RIRR和保

3、守的半胱氨酸殘基。組織逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)結(jié)果顯示，MSTN基因在肌肉、腦和精巢組織中大量表達(dá)，肝臟、脾臟和卵巢組織中的表達(dá)量次之，腸、腮、心臟、眼睛和腎組織中的微量表達(dá)。胚胎RT-PCR結(jié)果顯示，在0-44hpf胚胎發(fā)育階段，MSTN基因表達(dá)量較低；而在48hpf-52hpf胚胎發(fā)育階段，MSTN基因表達(dá)量逐漸升高。整胚原位雜交(WISH)結(jié)果顯示，胚胎發(fā)育的16hpf時(shí)期MSTN基因主要在脊索中表達(dá)，胚胎發(fā)育的28hpf、5

4、5hpf時(shí)期MSTN基因在腦中表達(dá)。MSTN基因過(guò)表達(dá)結(jié)果顯示，胚胎在體節(jié)發(fā)生期出現(xiàn)前-后軸伸長(zhǎng)，背-腹軸縮短；脊索發(fā)生扭曲、其生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制等現(xiàn)象。本研究為進(jìn)一步探索團(tuán)頭魴MSTN基因在生長(zhǎng)發(fā)育信號(hào)通路中的作用和育種提供了基礎(chǔ)資料。
　　肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子(midkine)屬于PTN家族，該家族由Mdk和PTN(pleiotrophin)兩個(gè)成員組成。Mdk是一種對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、遷移有重要作用的生長(zhǎng)因子。Mdk對(duì)不同組織尤其是

5、神經(jīng)組織的生長(zhǎng)、修復(fù)同樣起著重要的作用。本研究通過(guò)RACE法克隆獲得團(tuán)頭魴Mdka/-b重復(fù)基因cDNA序列。團(tuán)頭魴Mdka基因全長(zhǎng)1409bp，編碼區(qū)ORF大小為441bp，編碼146個(gè)氨基酸，包括22個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，124個(gè)氨基酸的成熟肽, Mdka前體蛋白等電點(diǎn)為9.57，相對(duì)分子量為15.73KD；團(tuán)頭魴Mdkb基因全長(zhǎng)1048bp，編碼區(qū)ORF大小為444bp，編碼147個(gè)氨基酸，包括21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，126個(gè)氨基酸的成

6、熟肽, Mdkb前體蛋白等電點(diǎn)為9.41，相對(duì)分子量為16.23KD。與人類、小鼠和斑馬魚一樣，團(tuán)頭魴Mdka/-b基因成熟多肽都包含10個(gè)保守的半胱氨酸殘基，一個(gè)精氨酸殘基，兩個(gè)谷氨酰胺殘基，一個(gè)高度保守的鉸鏈區(qū)和兩個(gè)堿基殘基簇。團(tuán)頭魴 Mdka和 Mdkb編碼區(qū)之間相似度為64％，與斑馬魚 Mdka和 Mdkb編碼區(qū)之間相似度分別為87%和95%，而與人類Mdk編碼區(qū)相似度較低（分別為57%和55%）。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(qRT-

7、PCR)分析結(jié)果表明，成魚組織中Mdka mRNA只在腦、性腺、腸中大量表達(dá)；而Mdkb mRNA除了皮膚外的所有成魚組織中都大量表達(dá)。在胚胎發(fā)育階段qRT-PCR分析結(jié)果顯示，Mdka基因 mRNA首次檢測(cè)到表達(dá)在受精后12h； Mdkb基因mRNA首次檢測(cè)到表達(dá)在受精后8h。在那之后，Mdka和 Mdkb mRNAs表達(dá)都穩(wěn)步上升，在受精后28h達(dá)到最大值，之后下降并逐漸保持穩(wěn)定。WISH結(jié)果表明 Mdka和Mdkb mRNAs在受

8、精后16h階段都是全身性表達(dá)；在受精后28h階段Mdka mRNA依然是全身性表達(dá)，Mdkb mRNA則只在眼睛、腦和尾節(jié)出表達(dá)；在受精后55 h階段時(shí)，Mdka和Mdkb都只在腦中表達(dá)。饑餓2、4、6天處理后，Mdka和 Mdkb mRNAs表達(dá)量在腦、肝臟和腸中表達(dá)量都上升，Mdka mRNA表達(dá)量在恢復(fù)投喂6天后恢復(fù)正常水平；Mdkb mRNA在腦、腸中表達(dá)量在恢復(fù)投喂3天后恢復(fù)正常水平，肝臟中Mdkb mRNA表達(dá)量在恢復(fù)投喂6

9、天后恢復(fù)正常水平。在注射重組人體生長(zhǎng)激素(hGH)處理過(guò)程中，與對(duì)照組相比，在注射50μg hGH肝臟、腸組織中Mdka和 Mdkb mRNAs表達(dá)量迅速下降；在注射10μg hGH的腸組織中Mdka和Mdkb mRNAs表達(dá)量也都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但它們表達(dá)量下降程度不一樣；在注射10μg和50μg hGH的腦組織中Mdka mRNA表達(dá)量迅速上升，而Mdkb mRNA表達(dá)量沒(méi)有顯著的變化。研究結(jié)果表明Mdka和Mdkb重復(fù)基因在團(tuán)頭魴胚

10、胎和組織發(fā)育過(guò)程中起著重要、但不同的作用。
　　三倍體團(tuán)頭魴在生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)、群體產(chǎn)量和抗逆性等方面具有明顯的優(yōu)勢(shì),四倍體團(tuán)頭魴與二倍體團(tuán)頭魴雜交可以快速、高效的獲得三倍體團(tuán)頭魴，為團(tuán)頭魴育種開創(chuàng)一種新的方法。本研究為獲得能夠穩(wěn)定遺傳的四倍體團(tuán)頭魴而進(jìn)行熱休克方法誘導(dǎo)處理團(tuán)頭魴受精卵抑制其第一次有絲分裂的研究。結(jié)果顯示，在熱休克2min條件下，40.5℃熱休克處理，團(tuán)頭魴受精卵發(fā)育30min誘導(dǎo)出苗率最高為8.33%；41℃熱休克處理，

11、團(tuán)頭魴受精卵36min誘導(dǎo)出苗率最高為5.65%；41.5℃熱休克處理，團(tuán)頭魴受精卵24min誘導(dǎo)出苗率最高為3.76%；42℃熱休克處理，團(tuán)頭魴受精卵30min誘導(dǎo)出苗率最高為4.02%。對(duì)熱休克誘導(dǎo)的團(tuán)頭魴進(jìn)行倍性分析分析其DNA含量，結(jié)果表明熱休克誘導(dǎo)只獲得二倍體和三倍體團(tuán)頭魴，沒(méi)有得到四倍體團(tuán)頭魴。對(duì)檢測(cè)出的二倍體和三倍體團(tuán)頭魴進(jìn)行染色體分析，其結(jié)果與倍性分析結(jié)果一致，可能是由于熱休克誘導(dǎo)的團(tuán)頭魴胚胎后期發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)了染色體丟

12、失所致，具體機(jī)理還需進(jìn)一步深入研究。四組溫度休克處理組中，42℃熱休克誘導(dǎo)處理團(tuán)頭魴受精卵獲得的三倍體團(tuán)頭魴率最高，為2.307%。倍性分析儀檢測(cè)DNA含量結(jié)果顯示，三倍體團(tuán)頭魴DNA含量約為正常二倍體團(tuán)頭魴DNA含量的1.5倍多。染色體分析結(jié)果顯示，正常二倍體團(tuán)頭魴的染色體48條；熱休克誘導(dǎo)的三倍體團(tuán)頭魴的染色體為72條，比二倍體團(tuán)頭魴多24條染色體。本研究采用熱休克法誘導(dǎo)處理團(tuán)頭魴受精卵為獲得四倍體團(tuán)頭魴進(jìn)行了初步研究，為后續(xù)團(tuán)頭魴