團頭魴生長相關基因(MSTN, Mdk)的克隆及熱休克誘導四倍體初步研究.pdf

1、團頭魴(Megalobrama amblycephala)，由于其生殖周期短、二齡即可達到性成熟，是研究肌肉生長、選育新品種的良好材料。
　　肌肉生長抑制素(Myostatin,MSTN)，又稱生長分化因子8(Growth differentiation factor8,GDF8)，屬于轉化生長因子β(Transforming growth factorβ,TGF-β)家族。該基因抑制骨骼肌的生長、發(fā)育。本研究通過cDNA末端快速

2、擴增法(RACE法)克隆得到團頭魴生長抑制素(MSTN)基因全長cDNA序列并分析了MSTN基因在團頭魴胚胎、成魚組織中表達以及MSTN基因在胚胎中過表達情況。結果顯示團頭魴MSTN基因的cDNA全長為2187bp，編碼區(qū)ORF(開放閱讀框)大小為1128bp，編碼376個氨基酸，推測的MSTN前體蛋白等電點為5.02，相對分子質量為92.34KDa。MSTN基因編碼蛋白包含有兩大TGF-β蛋白結構域、RXXR蛋白酶水解位點RIRR和保

3、守的半胱氨酸殘基。組織逆轉錄PCR(RT-PCR)結果顯示，MSTN基因在肌肉、腦和精巢組織中大量表達，肝臟、脾臟和卵巢組織中的表達量次之，腸、腮、心臟、眼睛和腎組織中的微量表達。胚胎RT-PCR結果顯示，在0-44hpf胚胎發(fā)育階段，MSTN基因表達量較低；而在48hpf-52hpf胚胎發(fā)育階段，MSTN基因表達量逐漸升高。整胚原位雜交(WISH)結果顯示，胚胎發(fā)育的16hpf時期MSTN基因主要在脊索中表達，胚胎發(fā)育的28hpf、5

4、5hpf時期MSTN基因在腦中表達。MSTN基因過表達結果顯示，胚胎在體節(jié)發(fā)生期出現前-后軸伸長，背-腹軸縮短；脊索發(fā)生扭曲、其生長發(fā)育受到抑制等現象。本研究為進一步探索團頭魴MSTN基因在生長發(fā)育信號通路中的作用和育種提供了基礎資料。
　　肝素結合生長因子(midkine)屬于PTN家族，該家族由Mdk和PTN(pleiotrophin)兩個成員組成。Mdk是一種對細胞生長、分化、遷移有重要作用的生長因子。Mdk對不同組織尤其是

5、神經組織的生長、修復同樣起著重要的作用。本研究通過RACE法克隆獲得團頭魴Mdka/-b重復基因cDNA序列。團頭魴Mdka基因全長1409bp，編碼區(qū)ORF大小為441bp，編碼146個氨基酸，包括22個氨基酸的信號肽，124個氨基酸的成熟肽, Mdka前體蛋白等電點為9.57，相對分子量為15.73KD；團頭魴Mdkb基因全長1048bp，編碼區(qū)ORF大小為444bp，編碼147個氨基酸，包括21個氨基酸的信號肽，126個氨基酸的成

6、熟肽, Mdkb前體蛋白等電點為9.41，相對分子量為16.23KD。與人類、小鼠和斑馬魚一樣，團頭魴Mdka/-b基因成熟多肽都包含10個保守的半胱氨酸殘基，一個精氨酸殘基，兩個谷氨酰胺殘基，一個高度保守的鉸鏈區(qū)和兩個堿基殘基簇。團頭魴 Mdka和 Mdkb編碼區(qū)之間相似度為64％，與斑馬魚 Mdka和 Mdkb編碼區(qū)之間相似度分別為87%和95%，而與人類Mdk編碼區(qū)相似度較低（分別為57%和55%）。實時熒光定量 PCR(qRT-

7、PCR)分析結果表明，成魚組織中Mdka mRNA只在腦、性腺、腸中大量表達；而Mdkb mRNA除了皮膚外的所有成魚組織中都大量表達。在胚胎發(fā)育階段qRT-PCR分析結果顯示，Mdka基因 mRNA首次檢測到表達在受精后12h； Mdkb基因mRNA首次檢測到表達在受精后8h。在那之后，Mdka和 Mdkb mRNAs表達都穩(wěn)步上升，在受精后28h達到最大值，之后下降并逐漸保持穩(wěn)定。WISH結果表明 Mdka和Mdkb mRNAs在受

8、精后16h階段都是全身性表達；在受精后28h階段Mdka mRNA依然是全身性表達，Mdkb mRNA則只在眼睛、腦和尾節(jié)出表達；在受精后55 h階段時，Mdka和Mdkb都只在腦中表達。饑餓2、4、6天處理后，Mdka和 Mdkb mRNAs表達量在腦、肝臟和腸中表達量都上升，Mdka mRNA表達量在恢復投喂6天后恢復正常水平；Mdkb mRNA在腦、腸中表達量在恢復投喂3天后恢復正常水平，肝臟中Mdkb mRNA表達量在恢復投喂6

9、天后恢復正常水平。在注射重組人體生長激素(hGH)處理過程中，與對照組相比，在注射50μg hGH肝臟、腸組織中Mdka和 Mdkb mRNAs表達量迅速下降；在注射10μg hGH的腸組織中Mdka和Mdkb mRNAs表達量也都呈現下降趨勢，但它們表達量下降程度不一樣；在注射10μg和50μg hGH的腦組織中Mdka mRNA表達量迅速上升，而Mdkb mRNA表達量沒有顯著的變化。研究結果表明Mdka和Mdkb重復基因在團頭魴胚

10、胎和組織發(fā)育過程中起著重要、但不同的作用。
　　三倍體團頭魴在生長優(yōu)勢、群體產量和抗逆性等方面具有明顯的優(yōu)勢,四倍體團頭魴與二倍體團頭魴雜交可以快速、高效的獲得三倍體團頭魴，為團頭魴育種開創(chuàng)一種新的方法。本研究為獲得能夠穩(wěn)定遺傳的四倍體團頭魴而進行熱休克方法誘導處理團頭魴受精卵抑制其第一次有絲分裂的研究。結果顯示，在熱休克2min條件下，40.5℃熱休克處理，團頭魴受精卵發(fā)育30min誘導出苗率最高為8.33%；41℃熱休克處理，

11、團頭魴受精卵36min誘導出苗率最高為5.65%；41.5℃熱休克處理，團頭魴受精卵24min誘導出苗率最高為3.76%；42℃熱休克處理，團頭魴受精卵30min誘導出苗率最高為4.02%。對熱休克誘導的團頭魴進行倍性分析分析其DNA含量，結果表明熱休克誘導只獲得二倍體和三倍體團頭魴，沒有得到四倍體團頭魴。對檢測出的二倍體和三倍體團頭魴進行染色體分析，其結果與倍性分析結果一致，可能是由于熱休克誘導的團頭魴胚胎后期發(fā)育過程中出現了染色體丟

12、失所致，具體機理還需進一步深入研究。四組溫度休克處理組中，42℃熱休克誘導處理團頭魴受精卵獲得的三倍體團頭魴率最高，為2.307%。倍性分析儀檢測DNA含量結果顯示，三倍體團頭魴DNA含量約為正常二倍體團頭魴DNA含量的1.5倍多。染色體分析結果顯示，正常二倍體團頭魴的染色體48條；熱休克誘導的三倍體團頭魴的染色體為72條，比二倍體團頭魴多24條染色體。本研究采用熱休克法誘導處理團頭魴受精卵為獲得四倍體團頭魴進行了初步研究，為后續(xù)團頭魴