異源四倍體鯽鯉性別決定相關(guān)基因Sox9的克隆及表達研究.pdf

1、該文綜合運用PCR亞克隆、RT-PCR以及Northern、Southern雜交等分子生物學技術(shù),對異源四倍體鯽鯉性別決定相關(guān)基因Sox9進行了研究,主要結(jié)論如下:(1)用特異于HMG-box(high mobility group-box)保守區(qū)的簡并引物擴增了異源四倍體鯽鯉及其原始親本(紅鯽和鯉魚)的Sox基因.異源四倍體鯽鯉的擴增產(chǎn)物共有四條帶,大小分別為200bp、600bp、900bp和1900bp左右,而在其原始母本紅鯽和原

2、始父本鯉魚中均只有三條擴增帶,大小分別為200bp、600bp和1900bp左右及200bp、500bp和900bp左右.這些結(jié)果表明在四倍體魚及其原始親本中存在SRY的同源基因,但在雌雄個體中均未發(fā)現(xiàn)性別特異擴增帶.四倍體魚不但兼有父母本的擴增帶,而且也有變異,為四倍體魚是異源四倍體而不是同源四倍體提供了分子生物學證據(jù).目前四倍體鯽鯉己連續(xù)繁殖了12代(F<,3>-F<,14>),形成了一個穩(wěn)定的新的四倍體魚繁殖群體.(2)回收雄性四

3、倍體魚200bp,600bp和900bp左右擴增帶,經(jīng)亞克隆及測序分析,200bp片段屬于HMG盒,600bp和900bp片段為2個新的編碼71個氨基酸殘基的基因Sox9a和Sox9b,通過計算機分析和RT-PCR方法確定,這2個基因均在HMG-box中含有內(nèi)含子,其插入位點符合gt-ag規(guī)則.(3)用地高辛標記的900bp片段做探針,斑點印跡結(jié)果顯示,Sox9基因明顯存在于四倍體魚基因組中.為進一步研究該基因的組織表達特異性,抽提四倍

4、體魚精巢、卵巢、肝臟、腦、心臟等組織總RNA進行Northern雜交,結(jié)果表明Sox9只在精巢、腦和心臟表達,而不在卵巢表達,且在精巢宏量表達,說明該基因在異源四倍體魚的精子發(fā)生及性別決定與分化中可能具有重要作用.而且,多組織RT-PCR及Southern印跡結(jié)果進一步證明Sox9在不同組織的差異表達.(4)從Northern雜交結(jié)果觀察到兩個轉(zhuǎn)錄子,大小分別為1.7kb和2.1kb,這表明四倍體魚中存在2個Sox9基因,但是否分別是S