四倍體鯽鯉BAC文庫構建及其演化分析.pdf

1、異源四倍體鯽鯉(Allotetraploid crucian-carp，簡稱AT)是通過紅鯽(Carassius auratus red var.，♀)與鯉魚(Cyprinus carpio L.，())遠緣雜交首次在脊椎動物中人工培育的兩性可育、遺傳性狀穩(wěn)定的四倍體魚。目前該四倍體鯽鯉品系目前已繁殖到第18代，形成了一個龐大的新型四倍體鯽鯉魚群體，該群體的形成在魚類演化和魚類遺傳育種具有重要意義。研究表明，四倍體鯽鯉與其二倍體父母本在

2、基因型和表現(xiàn)型均發(fā)生了改變。因此，有必要從基因組和轉錄組水平對其生物學特征進行較為系統(tǒng)的研究，并深入分析功能基因的篩選、遺傳標志的發(fā)現(xiàn)定位及經(jīng)濟形狀與基因功能關聯(lián)連鎖確定。并可為魚類多倍化形成機制提供新的信息，最終為魚類分子設計育種提供一個技術服務指導性平臺。
　　 本研究對F18異源四倍體鯽鯉新品系進行了BAC文庫構建及鑒定，對F18四倍體鯽鯉、紅鯽魚和鯉魚的肝臟轉錄組進行高通量測序研究、并對轉錄組序列進行生物信息學分析，獲得

3、的主要研究結果如下：
　　 1、首次構建新品系異源四倍體鯽鯉的BAC文庫，該文庫包含43200個克隆。構建BAC文庫采用全血細胞包埋瓊脂糖法制備HMWDNA，經(jīng)HindⅢ限制性酶切，脈沖場電泳(PFGE)分離選擇獲得150-300kb的DNA片段，通過電洗脫和透析純化HMW DNA，連接到線性磷酸化的克隆載體p CC1BAC上，轉化到大腸桿菌中。對構建的BAC文庫進行質量鑒定評估，插入DNA片段大小在110-310kb之間，平均

4、插入片段大小為190kb左右，具有約2.6倍左右的基因組覆蓋率。獲得的BAC文庫克隆，保存在450塊96孔板中，存放在-80℃冰柜備用。所建立的BAC文庫基本能滿足功能基因篩選、基因定位、進化機制、數(shù)量形狀連鎖分析及轉基因等研究的需要。
　　 2、異源四倍體鯽鯉、紅鯽和鯉魚的肝臟轉錄組測序共得到異源四倍體鯽鯉原始數(shù)據(jù)1.2GB，紅鯽原始數(shù)據(jù)934MB，鯉魚原始數(shù)據(jù)為1.1GB，用CLC BIO軟件對F18異源四倍體鯽鯉轉錄組數(shù)據(jù)

5、經(jīng)基本處理后產(chǎn)生Unigene數(shù)為9554條。
　　 3、使用EDEGR對F18與紅鯽拼接好的contigs進行基因差異表達分析(閾值設定為logFC>2)，結果顯示：F18與紅鯽相比，在肝臟轉錄組中6192個contigs表達上調(logFC>2，P<0.05)，有217個contigs表達下調(logFC>2，P<0.05)。F18與鯉魚相比，在肝臟轉錄組中4867個contigs表達上調(logFC>2，P<0.05)，有

6、578個contigs表達下調(logFC>2，P<0.05)。
　　 4、F18與紅鯽和鯉魚肝臟相比有差異contigs通過KEGG代謝途徑分析其功能差異。發(fā)現(xiàn)上調的基因主要在碳水化合物代謝、氨基酸代謝、脂代謝和能量代謝作用途徑中。GO分析表明，在分子生物學功能層次中binding和catalytic activity的差異基因占主要部分。在細胞組成水平層次中cytoplasm和organelle占主要部分。在生物過程層次中，

7、metabolic process和regulation of biological process的差異表達基因最多。
　　 5、與紅鯽的轉錄組及鯉魚轉錄組進行SV(structure variation)分析，結果表明：在異源四倍體鯽鯉的Unigenes中有185條Unigenes與紅鯽轉錄組的contig有基因融合，有192條Unigenes與鯉魚轉錄組的contig有基因融合。有24條Unigenes包含有紅鯽、鯉魚的基

8、因片段。
　　 6、對F18與紅鯽和鯉魚肝臟轉錄組進行SNP分析，首次發(fā)現(xiàn)：對比F18和紅鯽，共發(fā)現(xiàn)有SNP位點46449個；而與鯉魚相比其SNP位點共發(fā)現(xiàn)有59436個。相比較于紅鯽，F(xiàn)18與父本鯉魚的遺傳變異位點更多，證明了F18偏母性遺傳的特征。其中A型轉鐵蛋白transferrin variantA和MHC classⅠ antigen的變異位點較多，提示這兩個基因在F18中發(fā)生的變化較大，這可能對其抗逆能力的增加有作用

9、。
　　 7、Transferrin variant A和MHC classⅠ antigen的演化分析；從transferrin variant A構建的進化樹可以看出，該基因F18更偏向紅鯽，與紅鯽聚為一支，而與鯉魚相差較大；從MHC classⅠ antigen構建的進化樹可以看出，F(xiàn)18的MHC classⅠ antigen從序列上看更偏向鯉魚，而與紅鯽差異較大。從分子水平說明多倍體化過程中，基因偏向性選擇，每個基因面對