團頭魴BMP家族基因在肌間骨發(fā)生發(fā)育中的表達調(diào)控作用.pdf

1、團頭魴（Megalobrama amblycephala）屬于鯉形目，鯉科，魚自亞科，魴屬，又名武昌魚，是我國一種特有的淡水養(yǎng)殖魚類，由于其肉質(zhì)鮮美、頭小、含肉率高等優(yōu)點，已被作為優(yōu)良的草食性魚類品種在全國范圍內(nèi)推廣。團頭魴和其他大多數(shù)淡水魚類如鯽（Carassius carassius）、草魚（Ctenopharyngodon idella）、鰱（Hypophthalmichthys molitrix）等一樣存在大量且形態(tài)復(fù)雜的肌間骨

2、。肌間骨的存在嚴重阻礙了這些魚類的深加工及食用價值。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic proteins，BMPs)是一類具有多功能的生長因子，參與各種生理過程，對骨和軟骨形成具有重要的作用。
　　為了探索BMP家族基因在團頭魴肌間骨發(fā)生發(fā)育過程中的調(diào)控作用，本實驗通過基因克隆方法獲得了團頭魴9個BMP基因的cDNA全長，采用定量PCR方法檢測這些基因在仔稚魚肌間骨不同發(fā)育時期的表達變化及其在一齡與二齡魚八個組織

3、中的表達差異性，并進一步采用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除斑馬魚bmp3基因以研究此基因?qū)￠g骨發(fā)育的影響。主要研究內(nèi)容如下:
　　(1)使用同源克隆及RACE技術(shù)獲得了9個BMP基因(bmp2a、bmp2b、bmp3、bmp4、bmp5、bmp7b、bmp8a、bmp14和bmp16)的cDNA全長，通過比較團頭魴BMP家族基因與Ensembl或者GenBank數(shù)據(jù)庫中8種魚類、8種非魚類的BMP家族成員的氨基酸序列信息，構(gòu)建系

4、統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明:團頭魴與斑馬魚的親緣關(guān)系最近，然后與其他硬骨魚類聚為一支，與哺乳動物的親緣關(guān)系較遠，這樣的進化關(guān)系符合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)上各物種的分類地位，預(yù)示每個BMP基因的功能在整個進化過程中也是保守的。這些結(jié)果為BMPs在團頭魴肌間骨發(fā)生發(fā)育中發(fā)揮的作用提供了理論依據(jù)。
　　(2)為了確定9個BMP家族基因在魚類不同組織生長發(fā)育中過程中可能所發(fā)揮的不同功能，本研究使用半定量PCR技術(shù)分析了BMP基因在一齡與二齡團頭魴組織分布情況

5、。實驗結(jié)果表明:大多數(shù)BMP基因在鈣化組織肌間骨、肋骨和鰭條中觀察到高表達，也進一步驗證了BMP基因在魚類骨代謝中的重要作用;bmp2a、bmp2b、bmp3、bmp4、bmp5、bmp8a、bmp14和bmp16mRNA在一齡幼魚的肌間骨中表達最高，提示這些BMP基因在肌間骨生長和維持中起關(guān)鍵作用;bmp3具有廣泛表達特性;除了bmp3，大多數(shù)BMP基因在一齡和二齡團頭魴中組織分布情況明顯不同。
　　(3)為了探討9個BMP基因

6、對團頭魴肌間骨發(fā)育的調(diào)控作用，本研究使用熒光定量PCR(qRT-PCR)方法分析了BMP基因在四個肌間骨不同生長發(fā)育時期的表達模式，結(jié)果顯示:在從Ⅰ期（肌間骨尚未出現(xiàn)）到Ⅳ期的骨化過程（具有成熟形態(tài)的肌間骨在尾部骨化完全）中，表達譜顯示bmp16是最豐富的轉(zhuǎn)錄物，而bmp4具有最低豐度;bmp3、bmp4、bmp5和bmp8a的mRNA水平在Ⅱ期顯著增加，表明它們在刺激肌間骨形成中的作用;bmp7b的表達在Ⅲ期（肌間骨發(fā)展的快速階段）達

7、到最高水平，提示bmp7b可能參與促進成骨細胞分化。除bmp7b和bmp16外，大多數(shù)BMP基因在肌間骨成熟階段（Ⅳ期）出現(xiàn)顯著增加，這意味著它們可能在維持IB形態(tài)發(fā)生中起重要作用。
　　(4)以斑馬魚作為實驗材料，通過CRISPER/Cas9技術(shù)構(gòu)建了兩個bmp3敲除品系bmp3+14和bmp3-2，觀察其肌間骨表型與野生斑馬魚的差異，探討bmp3基因上下游調(diào)控基因的表達變化。茜素紅骨骼染色結(jié)果表明，斑馬魚突變體未出現(xiàn)畸形表型，